丁香假單胞菌番茄致病變種和煙草致病變種egfp標(biāo)記突變體的構(gòu)建.pdf

1、植物病原細(xì)菌的三型分泌系統(tǒng)(TTSS)是丁香假單胞菌(Pseudomonaa syringae)侵染過程中重要的蛋白分泌系統(tǒng)。TTSS的編碼、蛋白分泌等受到hrp基因的調(diào)節(jié)。研究hrp基因在病菌侵染過程中的表達(dá)情況有助于進(jìn)一步探索hrp基因的功能,揭示植物病原細(xì)菌的分子致病機(jī)制,而egfp標(biāo)記突變體的構(gòu)建是開展寄主.病原物的互作研究的重要策略。
　　 本試驗(yàn)擬以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)作為報(bào)告基因,以植物丁香假單胞菌煙

2、草致病變種和番茄致病變種為材料,以其hrpA基因和hrpZ基因?yàn)榘袠?biāo),通過體外重組和雙親結(jié)合技術(shù),分別構(gòu)建靶標(biāo)基因與egfp融合表達(dá)的突變體,以及靶標(biāo)基因缺失的egfp標(biāo)記突變體,為今后研究丁香假單胞菌.植物的互作提供有用的材料工具。主要試驗(yàn)結(jié)果為:
　　 (1)以丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000菌株和煙草致病變種4號(hào)菌株的基因組DNA為模板,擴(kuò)增出hrpA、hrpZ基因及其上下游片段；以pEGFP-C1為模板擴(kuò)增出了egf

3、p ORF全長。將相關(guān)的DNA片段進(jìn)行體外重組后,得到了4個(gè)與預(yù)期大小一致的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4,它們分別為hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型片段和ΔhrpZPsta::egfp缺失型片段,為下一步構(gòu)建融合型、缺失型突變體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　 (2)試驗(yàn)將獲得的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4分別連接至克隆載體pMD19-T

4、,提取陽性克隆質(zhì)粒pMD19-CDE3、pMD19-CTE1、pMD19-CTE3、pMD19-CTE4的DNA與自殺型質(zhì)粒pKSM1的DNA同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切,切膠回收的酶切片段進(jìn)行連接,得到了適于進(jìn)行雙親接合所用的自殺型重組質(zhì)粒pKSM-CDE3、pKSM—CTE1、pKSM-CTE3、pKSM—CTE4。
　　 (3)將含有質(zhì)粒pKSM-CDE3的大腸桿菌S17-1與番茄致病變種DC3000野生型菌株進(jìn)行雙

5、親接合后獲得了hrpZPto::egfp融合型突變體；將含有質(zhì)粒pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4的大腸桿菌S17-1分別與煙草致病變種4號(hào)菌野生型菌株進(jìn)行雙親結(jié)合獲得了hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突變體和ΔhrpZPsta::egfp缺失型突變體。將獲得的4個(gè)突變體菌株劃線于KB培養(yǎng)基(30μg/ml Nalr)上,在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)hrpAPsta::egfp融合型突變體有

6、明顯的綠色熒光,而hrpZPto::egfp,hrpAPsta::egfp融合型突變體及△hrpZPsta::egfp缺失型突變體則無綠色熒光。
　　 (4)與野生型菌株相比,以上構(gòu)建的4個(gè)egfp標(biāo)記突變體人工接種煙草后,pv.tomatoDC3000的hrpZPto::egfp融合型突變體的過敏性誘導(dǎo)能力明顯降低；hrpAPsta::egfp,hrpZPsta::egfp融合型突變體及ΔhrpZPsta::egfp缺失型突變