菌根菌侵染lept4突變體和野生型番茄

1、:www.paper.1菌根菌侵染菌根菌侵染lept4突變體和野生型番茄對(duì)砷吸收和響應(yīng)差異的比較突變體和野生型番茄對(duì)砷吸收和響應(yīng)差異的比較1王萍，陳愛(ài)群，顧冕，胡江，孫淑斌，徐國(guó)華南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)院植物營(yíng)養(yǎng)系，南京(210095)Email：ghxu@njau.摘要：要：通過(guò)Glomusintraradices菌根侵染番茄LePT4（菌根特異性誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因）突變體(lept4)和其MicroTom野生型(WT)對(duì)磷和砷的吸收

2、和響應(yīng)差異的比較發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有砷處理情況下，LePT4突變極其顯著地降低了番茄從菌絲體獲取磷素的能力和菌根菌侵染對(duì)番茄生長(zhǎng)的改善。0.05mM外源砷的添加顯著降低了菌根菌對(duì)于lept4突變體植株根部的侵染，而對(duì)野生型材料侵染率的影響無(wú)顯著差異。添加外源砷沒(méi)有顯著影響兩個(gè)受菌根特異性調(diào)控表達(dá)的番茄磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LePT4和LePT5的表達(dá)。但相對(duì)于野生型，無(wú)論是相對(duì)生長(zhǎng)量還是砷的吸收，LePT4突變均不能增強(qiáng)對(duì)0.05mM外源砷的抗性。

3、接種菌根菌的植株地上部和地下部的砷累積均極顯著降低。無(wú)論有沒(méi)有菌根菌的侵染，LePT4的突變均不影響番茄對(duì)砷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，在番茄植株中砷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)可能有不同的途徑。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：番茄；砷；菌根菌；突變體；磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中圖分類(lèi)號(hào)：中圖分類(lèi)號(hào)：Q9351.引言引言植物體通過(guò)一系列改變根際環(huán)境的方式來(lái)吸收的無(wú)機(jī)態(tài)磷素營(yíng)養(yǎng)，這些磷通過(guò)根系細(xì)胞膜進(jìn)入植物體是由同一或不同家族的多個(gè)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)介質(zhì)中有效磷濃度的

4、高低，編碼磷素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可以粗分為Km值在mM范圍內(nèi)的低親合力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LowAffinity）和Km值在M范圍內(nèi)的高親合力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HighAffinity）兩大類(lèi)（Muchhal等，1996）。磷和砷元素都是位于元素周期表中的第五主族，相似的電子層結(jié)構(gòu)使得它們?cè)谖锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)上也有類(lèi)似。已經(jīng)有許多研究表明，由于砷和磷的這種相似性，使得砷及其化合物很容易就會(huì)通過(guò)植物細(xì)胞膜上高親和的磷素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入到體內(nèi)，同時(shí)植物體對(duì)砷具

5、有更高的敏感性（Meharg等，1990，1991b，1992b和2002；Bleeker等，2003）。目前在番茄植株體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要有五個(gè)，它們分別是缺磷增強(qiáng)表達(dá)的LePT1和LePT2基因，菌根誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的LePT3基因，以及由菌根專(zhuān)性誘導(dǎo)表達(dá)的LePT4和LePT5基因（Liu等，1998a；Nagy等，2005；Chen等，2007；Xu等，2007）。我們以一個(gè)菌根專(zhuān)性誘導(dǎo)表達(dá)的番茄磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因LeP

6、T4的突變體（lept4）及其野生型為材料，研究了它們?cè)趯?duì)砷的吸收及其他一系列生理響應(yīng)上的差異，以及外源砷對(duì)于二者體內(nèi)各磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響，從而揭示各磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在砷的吸收上的功能和意義，為將以磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因用在砷污染的環(huán)境修復(fù)上的設(shè)想提供了理論研究基礎(chǔ)。1本課題得到高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金“用雙向遺傳學(xué)途徑結(jié)合研究影響番茄利用無(wú)機(jī)磷效率的分子生物學(xué)基礎(chǔ)“項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：20040307037國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“用反

7、向遺傳學(xué)途徑研究番茄磷素運(yùn)輸?shù)鞍椎纳砉δ堋绊?xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：30471037江蘇省自然科學(xué)基金“植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體Pht1家族基因的功能及其表達(dá)調(diào)控分析“編號(hào)：BK2005089的資助。:www.paper.32.4.2植株全磷含量植株全磷含量稱(chēng)取烘干的粉碎植株干樣0.1g（精確至0.0001g）左右，置于100ml消化管中，通過(guò)H2SO4H2O2高溫消煮后，采用鉬銻抗比色法（鮑士旦，2000），722型分光光度計(jì)，700nm波長(zhǎng)下比色，分別

8、測(cè)定植株地上部和地下部的全磷含量。2.4.3植株砷含量植株砷含量采用氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法（李貴峰，1999）。稱(chēng)取烘干的粉碎植株干樣0.1（精確至0.0001g）左右，置于高腳燒杯中，通過(guò)HNO3HClO4（4：1VV）在不高于180℃下消煮后，采用AF600（北京瑞利）系列原子熒光光譜儀分析法分別測(cè)定地上部和地下部的砷含量，測(cè)定參數(shù)按照儀器說(shuō)明書(shū)。試驗(yàn)中的砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為GBW07604。2.4.4菌根侵染率菌根侵染率采用McG

9、onigle（1990）和David（2001）的菌根侵染檢測(cè)計(jì)算的方法。取0.20.5g新鮮的根，剪成1cm左右的根段后，裝入根盒中，先置于10％的氫氧化鉀溶液中，在90℃水浴中加熱30min之后，將堿液倒掉，用自來(lái)水沖洗3次，再加2％的鹽酸溶液浸泡5min。將鹽酸溶液倒掉，直接加0.5％的染料（trypanblue：400ml85％乳酸，chlazoleblackE：1.2g，蒸餾水：400ml）溶液，在90℃的水浴加熱30min。

10、將染色液倒掉，仍用自來(lái)水沖洗3次后，直接將根段至于帶有等間距方格的9cm培養(yǎng)皿，加入適量的蒸餾水后，在顯微鏡（Leica，DMR，Germany）下觀測(cè)，利用網(wǎng)格交叉法來(lái)算出侵染率。侵染率的計(jì)算公式：侵染率（％）＝被侵染的根段數(shù)100總根段數(shù)2.4.5組織總組織總RNA制備制備取凍存樣品100mg液氮?jiǎng)驖{后加入Trizol試劑1ml加入0.2ml氯仿離心后吸取上清液加入0.5ml異丙醇離心沉淀后棄上清液再用70％乙醇洗沉淀用DNaseI

11、酶解可能殘余的基因組DNA。RNA溶于1‰DEPC水用凝膠電泳法和分光光度計(jì)法檢測(cè)其濃度和純度。2.4.6cDNA合成合成每個(gè)總RNA樣品取2g，加入50molL1Oligo(dT18)，加無(wú)RNase水補(bǔ)足10L，70℃下水浴5min，室溫放置5min后，依次加入RNaseinhibit0.5L，5RTbuffer5L，5mmolL1dNTP2.5L，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1L，無(wú)RNase水補(bǔ)足25L，42℃水浴60min后，70℃水浴1