菌根菌侵染lept4突變體和野生型番茄

1、:www.paper.1菌根菌侵染菌根菌侵染lept4突變體和野生型番茄對砷吸收和響應差異的比較突變體和野生型番茄對砷吸收和響應差異的比較1王萍，陳愛群，顧冕，胡江，孫淑斌，徐國華南京農(nóng)業(yè)大學資環(huán)院植物營養(yǎng)系，南京(210095)Email：ghxu@njau.摘要：要：通過Glomusintraradices菌根侵染番茄LePT4（菌根特異性誘導表達的磷酸鹽轉運基因）突變體(lept4)和其MicroTom野生型(WT)對磷和砷的吸收

2、和響應差異的比較發(fā)現(xiàn)，在沒有砷處理情況下，LePT4突變極其顯著地降低了番茄從菌絲體獲取磷素的能力和菌根菌侵染對番茄生長的改善。0.05mM外源砷的添加顯著降低了菌根菌對于lept4突變體植株根部的侵染，而對野生型材料侵染率的影響無顯著差異。添加外源砷沒有顯著影響兩個受菌根特異性調(diào)控表達的番茄磷酸鹽轉運蛋白基因LePT4和LePT5的表達。但相對于野生型，無論是相對生長量還是砷的吸收，LePT4突變均不能增強對0.05mM外源砷的抗性。

3、接種菌根菌的植株地上部和地下部的砷累積均極顯著降低。無論有沒有菌根菌的侵染，LePT4的突變均不影響番茄對砷的吸收和轉運，因此，在番茄植株中砷的吸收和轉運可能有不同的途徑。關鍵詞：關鍵詞：番茄；砷；菌根菌；突變體；磷酸鹽轉運蛋白基因中圖分類號：中圖分類號：Q9351.引言引言植物體通過一系列改變根際環(huán)境的方式來吸收的無機態(tài)磷素營養(yǎng)，這些磷通過根系細胞膜進入植物體是由同一或不同家族的多個磷轉運蛋白基因來實現(xiàn)的。依據(jù)轉運時介質(zhì)中有效磷濃度的

4、高低，編碼磷素轉運蛋白基因可以粗分為Km值在mM范圍內(nèi)的低親合力磷酸鹽轉運系統(tǒng)（LowAffinity）和Km值在M范圍內(nèi)的高親合力磷酸鹽轉運系統(tǒng)（HighAffinity）兩大類（Muchhal等，1996）。磷和砷元素都是位于元素周期表中的第五主族，相似的電子層結構使得它們在物理和化學性質(zhì)上也有類似。已經(jīng)有許多研究表明，由于砷和磷的這種相似性，使得砷及其化合物很容易就會通過植物細胞膜上高親和的磷素轉運蛋白進入到體內(nèi)，同時植物體對砷具

5、有更高的敏感性（Meharg等，1990，1991b，1992b和2002；Bleeker等，2003）。目前在番茄植株體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的磷酸鹽轉運蛋白基因主要有五個，它們分別是缺磷增強表達的LePT1和LePT2基因，菌根誘導增強表達的LePT3基因，以及由菌根專性誘導表達的LePT4和LePT5基因（Liu等，1998a；Nagy等，2005；Chen等，2007；Xu等，2007）。我們以一個菌根專性誘導表達的番茄磷酸鹽轉運蛋白基因LeP

6、T4的突變體（lept4）及其野生型為材料，研究了它們在對砷的吸收及其他一系列生理響應上的差異，以及外源砷對于二者體內(nèi)各磷酸鹽轉運蛋白基因表達的影響，從而揭示各磷酸鹽轉運蛋白在砷的吸收上的功能和意義，為將以磷酸鹽轉運蛋白基因用在砷污染的環(huán)境修復上的設想提供了理論研究基礎。1本課題得到高等學校博士學科點專項科研基金“用雙向遺傳學途徑結合研究影響番茄利用無機磷效率的分子生物學基礎“項目批準號：20040307037國家自然科學基金項目“用反

7、向遺傳學途徑研究番茄磷素運輸?shù)鞍椎纳砉δ堋绊椖颗鷾侍枺?0471037江蘇省自然科學基金“植物磷酸鹽轉運體Pht1家族基因的功能及其表達調(diào)控分析“編號：BK2005089的資助。:www.paper.32.4.2植株全磷含量植株全磷含量稱取烘干的粉碎植株干樣0.1g（精確至0.0001g）左右，置于100ml消化管中，通過H2SO4H2O2高溫消煮后，采用鉬銻抗比色法（鮑士旦，2000），722型分光光度計，700nm波長下比色，分別

8、測定植株地上部和地下部的全磷含量。2.4.3植株砷含量植株砷含量采用氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法（李貴峰，1999）。稱取烘干的粉碎植株干樣0.1（精確至0.0001g）左右，置于高腳燒杯中，通過HNO3HClO4（4：1VV）在不高于180℃下消煮后，采用AF600（北京瑞利）系列原子熒光光譜儀分析法分別測定地上部和地下部的砷含量，測定參數(shù)按照儀器說明書。試驗中的砷標準物質(zhì)編號為GBW07604。2.4.4菌根侵染率菌根侵染率采用McG

9、onigle（1990）和David（2001）的菌根侵染檢測計算的方法。取0.20.5g新鮮的根，剪成1cm左右的根段后，裝入根盒中，先置于10％的氫氧化鉀溶液中，在90℃水浴中加熱30min之后，將堿液倒掉，用自來水沖洗3次，再加2％的鹽酸溶液浸泡5min。將鹽酸溶液倒掉，直接加0.5％的染料（trypanblue：400ml85％乳酸，chlazoleblackE：1.2g，蒸餾水：400ml）溶液，在90℃的水浴加熱30min。

10、將染色液倒掉，仍用自來水沖洗3次后，直接將根段至于帶有等間距方格的9cm培養(yǎng)皿，加入適量的蒸餾水后，在顯微鏡（Leica，DMR，Germany）下觀測，利用網(wǎng)格交叉法來算出侵染率。侵染率的計算公式：侵染率（％）＝被侵染的根段數(shù)100總根段數(shù)2.4.5組織總組織總RNA制備制備取凍存樣品100mg液氮勻漿后加入Trizol試劑1ml加入0.2ml氯仿離心后吸取上清液加入0.5ml異丙醇離心沉淀后棄上清液再用70％乙醇洗沉淀用DNaseI

11、酶解可能殘余的基因組DNA。RNA溶于1‰DEPC水用凝膠電泳法和分光光度計法檢測其濃度和純度。2.4.6cDNA合成合成每個總RNA樣品取2g，加入50molL1Oligo(dT18)，加無RNase水補足10L，70℃下水浴5min，室溫放置5min后，依次加入RNaseinhibit0.5L，5RTbuffer5L，5mmolL1dNTP2.5L，MMLV反轉錄酶1L，無RNase水補足25L，42℃水浴60min后，70℃水浴1