真菌蛋白激發(fā)子Hrip1誘導(dǎo)水稻抗病性及互作蛋白的鑒定.pdf

1、真菌蛋白激發(fā)子Hrip1是從極鏈格孢菌(Alternaria alternata)中分離得到的一種超敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，分子量為17.6KD。Hrip1誘導(dǎo)煙草細(xì)胞壞死、介質(zhì)堿化、鈣離子流動(dòng)和ROS積累等一系列防御反應(yīng)，并且提高煙草對(duì)TMV的系統(tǒng)抗性。為了進(jìn)一步研究Hrip1蛋白在水稻上的功能，明確Hrip1誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生防御反應(yīng)的機(jī)制。本研究在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)蛋白激發(fā)子Hrip1，并研究Hrip1誘導(dǎo)水稻抗稻瘟病的作用;通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)

2、篩選Hrip1在水稻中的互作蛋白，同時(shí)利用GST pull down進(jìn)一步證明了二者的相互作用;為了研究互作蛋白的功能，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)得到了互作蛋白基因敲除的水稻突變株。獲得了以下研究成果:
　　1、成功進(jìn)行了Hrip1的真核細(xì)胞表達(dá)
　　成功構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)載體pPICZαA-Hrip1，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過(guò)Zeoc in濃度梯度篩選獲得了正確的酵母轉(zhuǎn)化子。通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化得

3、到了純化的重組蛋白。Westernblot檢測(cè)證明了表達(dá)該蛋白為Hrip1。重組蛋白Hrip1具有天然Hrip1蛋白的活性，可以引起草葉片過(guò)敏性壞死反應(yīng)，最低作用濃度為10μM。
　　2、Hrip1誘導(dǎo)水稻的抗病性反應(yīng)
　　用濃度為30μM的Hrip1處理水稻，48小時(shí)后噴霧接種稻瘟菌孢子懸浮液，結(jié)果表明Hrip1能夠明顯提高水稻對(duì)稻瘟菌的抗性，水稻細(xì)胞內(nèi)源水楊酸含量升高，并在48小時(shí)達(dá)到最高值;防御反應(yīng)相關(guān)酶PAL、POD

4、、CAT活性也顯著提高。這些結(jié)果表明，Hrip1可以誘導(dǎo)水稻的防御反應(yīng)，可能通過(guò)水楊酸途徑激活了水稻對(duì)稻瘟菌的抗性。
　　3、篩選獲得了Hrip1水稻互作蛋白
　　為了探究Hrip1誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性的機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，成功在水稻cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)Hrip1互作蛋白，命名為Hrip1-BP。Hrip1-BP在擬南芥中的同源蛋白為CSN5，是一個(gè)類泛素蛋白，在植物與病原物的互作中發(fā)揮重要作用。
　　4、體外

5、驗(yàn)證了Hrip1與水稻中互作蛋白的特異性
　　根據(jù)水稻庫(kù)中Hrip1-BP的序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，得到了Hrip1-BP的全長(zhǎng)表達(dá)序列。通過(guò)構(gòu)建pGEX-6p-2-Hrip1-BP重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，成功得到了可溶性Hrip1-BP重組蛋白。用GST pull down技術(shù)驗(yàn)證了Hrip1-BP能夠與Hrip1相互作用。
　　5、獲得了敲除互作蛋白基因水稻突變體
　　為了進(jìn)一步闡明Hrip1-BP