硫氧還蛋白與生物激發(fā)子對(duì)植物抗病性的調(diào)控與誘導(dǎo)作用.pdf

1、植物體中的硫氧還蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)控很多酶的活性，最終在植物的氧化還原調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)、發(fā)育和抗病等過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。本論文就煙草中一個(gè)被氧脅迫和病毒所特異性誘導(dǎo)的硫氧還蛋白--NtTRXh展開(kāi)研究，通過(guò)一系列的生物化學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)手段，對(duì)其結(jié)構(gòu)和消除植物體內(nèi)多余活性氧、增強(qiáng)植物抗病性的功能進(jìn)行了較詳細(xì)的闡釋.另外一種可以提高植物抗病性的蛋白質(zhì)--激發(fā)子HrpNEa，它是植物病原細(xì)菌（梨火疫病菌Erwin

2、ia amylovora）產(chǎn)生的一種Ⅲ型效應(yīng)因子。將它外源噴施于植物地上部分時(shí)，可以誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性.然而，它能否作用于植物根部呢?為此，本論文選擇大白菜與軟腐病菌這一互作系統(tǒng)來(lái)研究HrpNEa是否能在植物根部誘導(dǎo)抗病性。
　　 1.NtTRXh基因克隆、表達(dá)及功能的分析
　　 實(shí)驗(yàn)證明，普通煙草中目前發(fā)現(xiàn)的三個(gè)h型TRX（Nicotiana tabacum thioredoxin h-like protein）基因（Nt

3、 TRXhl, Nt TRXh2, Nt TRXh）中的NtTRXh(AF435818)特異性的受到氧脅迫劑百草枯(Paraquat)和病毒TMV的誘導(dǎo)表達(dá)，并克隆了該基因。序列的同源性分析表明，NtTRXh具有完整的TRX蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)WCGPC，屬于thioredoxinh中的第三亞家族.在大腸桿菌內(nèi)表達(dá).NtTRXh，并利用金屬螯合層析(Ni柱)純化.125μg/ml純化后的NtTRXh溶液不能引起煙草葉片的過(guò)敏反應(yīng)，這說(shuō)明Nt

4、TRXh本身對(duì)植物的細(xì)胞沒(méi)有損害.根據(jù)TRX蛋白質(zhì)催化胰島素二硫鍵的性質(zhì)，測(cè)定了NtTRXh的催化活性，判定它具備催化二硫鍵（TRX蛋白質(zhì)的特性）的性質(zhì).然后，我們利用PCR點(diǎn)突變的方法將其功能域上的兩個(gè)位點(diǎn)突變，并表達(dá)、純化得到的三個(gè)突變體(C13T， C68T， C13TC68T).同時(shí)，再次利用TRX蛋白質(zhì)催化胰島素二硫鍵的性質(zhì)，平行測(cè)定了NtTRXh及三個(gè)點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)活性。結(jié)果表明，除活性位點(diǎn)WCGPC中的兩個(gè)半胱氨酸(C)殘

5、基外，N端的一個(gè)半胱氨酸殘基也參與了二硫鍵的催化反應(yīng).總之，我們克隆了煙草上可能參與清除活性氧和抗病功能的NtTRXh，將其進(jìn)行表達(dá)純化，并對(duì)它的活性和功能域進(jìn)行了分析.
　　 2.NtTRXh增強(qiáng)煙草的抗病性而抑制煙草生長(zhǎng)
　　 植物中存在許多TRXhs，這些蛋白在植物中的氧化還原調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)、發(fā)育和抗病等方面發(fā)揮著重要的作用。但是，大部分TRXh的功能還不清楚.前面的結(jié)果表明，Nt TRXh可以被百草枯（誘導(dǎo)氧爆發(fā)）和

6、病毒TMV誘導(dǎo)表達(dá)。為了鑒定NtTRXh在煙草中的功能，將其連接到可以被Harpin誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PPP1前面，并構(gòu)建到過(guò)量表達(dá)載體pBI121上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。接著利用葉盤法進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因，讓該基因在煙草中過(guò)量表達(dá)。同時(shí)，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)將NtTRXh沉默.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用百草枯處理后，過(guò)量表達(dá)的植株(TRXOT1)中的活性氧比轉(zhuǎn)空載體植株(ETT)少了很多.與此同時(shí)，當(dāng)接種TMV時(shí)，在TRXOT1中，病斑明顯減

7、小了，抗病相關(guān)基因的表達(dá)比ETT增強(qiáng)了.此外，我們還發(fā)現(xiàn)，煙草的生長(zhǎng)明顯受到了抑制，煙草中與生長(zhǎng)相關(guān)的基因表達(dá)減弱了.因此，NtTRXh不僅可以消除活性氧，增強(qiáng)抗病性，而且還抑制了植物的生長(zhǎng)。同樣，我們?cè)赪T和沉默植株（SiTRX）上也做了以上實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，雖然WT和SiTRX之間存在的差別不如TRXOT1與ETT之間的差別大，但是同樣證明了NtTRXh的功能.綜上所述，我們通過(guò)過(guò)量表達(dá)與病毒誘導(dǎo)的基因沉默的方法，研究了NtTRXh在

8、植物體內(nèi)的功能，發(fā)現(xiàn)它可以消除活性氧，增強(qiáng)抗病性，而且抑制了植物的生長(zhǎng).
　　 3.NtTRXh在煙草中的亞細(xì)胞定位
　　 蛋白質(zhì)是生物功能的直接體現(xiàn)者，有序分布的蛋白質(zhì)是保證生命個(gè)體正常生長(zhǎng)、發(fā)育的前提.植物基因的編碼蛋白都是依據(jù)自身氨基酸序列所包含的定位信息，由精確的制導(dǎo)機(jī)制定位到細(xì)胞的特定部位的.蛋白質(zhì)因目的地不同，而功能也不盡相同.因此，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究對(duì)于系統(tǒng)地了解蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的作用是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)

9、.因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)NtTRXh可以被百草枯誘導(dǎo)表達(dá)，而且又因?yàn)榘俨菘莩莸臋C(jī)理是：它能被植物綠色組織吸收，在植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)氧化物，對(duì)植物綠色組織有很強(qiáng)的破壞作用，使光合作用和葉綠素合成很快中止，使綠色植物枯死，所以我們推測(cè)NtTRXh有可能定位于葉綠體，雖然還沒(méi)有TRXhs定位于葉綠體的報(bào)道.而后，我們利用生物信息學(xué)方法分析、預(yù)測(cè)NtTRXh的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)它沒(méi)有明顯定位某個(gè)細(xì)胞器的信號(hào)肽.根據(jù)氨基酸組成算法預(yù)測(cè)，認(rèn)為它可能定位于葉綠體、

10、細(xì)胞質(zhì)或者線粒體.為了確證它的亞細(xì)胞定位情況，我們利用免疫學(xué)的方法分析鑒定NtTRXh在煙草葉片上的亞細(xì)胞定位.我們將NtTRXh表達(dá)、純化，通過(guò)免疫兔子制備了NtTRXh的多克隆抗體.再通過(guò)Westem blot和免疫膠體金對(duì)NtTRXh的定位進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠體、細(xì)胞質(zhì)或者線粒體中都有NtTRXh，而葉綠體中較多.這與我們?cè)鹊耐茰y(cè)基本是一致的.而且，因?yàn)樗膹V泛分布，這從一定程度上解釋了它可能參與了細(xì)胞的多種生理生化過(guò)程，在植

11、物中發(fā)揮著多種重要的功能.
　　 4.HrpNEa誘導(dǎo)大白菜對(duì)軟腐菌從根部侵染的抗性
　　 蛋白質(zhì)激發(fā)子HrpNEa是植物病原細(xì)菌（梨火疫病菌Erwinia amylovora）產(chǎn)生的一種Ⅲ型效應(yīng)因子。外源噴施于植物地上部分時(shí)，可以誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗病性。然而，HrpNEa是否可以作用于植物根部幾乎沒(méi)有研究。本研究基于對(duì)HrpNEa的研究空缺和軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora

12、, Ecc）可以從根部侵染大白菜的特點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，解析誘導(dǎo)大白菜抵抗軟腐病菌從根部侵染的機(jī)制。首先利用熒光顯微鏡和電鏡觀察軟腐病菌在根部的吸附，發(fā)現(xiàn)HrpNEa處理大白菜根部以后，不僅可以改變軟腐病菌在根表的極性吸附形式，還可以降低軟腐病菌在根表極性吸附的數(shù)量和吸附的總量。同時(shí)，利用報(bào)告菌檢測(cè)軟腐病菌群體感應(yīng)分子的產(chǎn)生情況.群體感應(yīng)是軟腐病菌在侵染寄主過(guò)程中重要的影響因素.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HrpNEa處理大白菜根部以后，大大抑制了軟腐病菌產(chǎn)生群

13、體感應(yīng)分子的能力.最后，檢測(cè)了一些抗病相關(guān)基因等的表達(dá)情況.總之，HrpNEa處理大白菜根部可以影響軟腐病菌在大白菜根表的侵染行為，從而提高了對(duì)軟腐病菌的抗性，這揭示了植物中一種新的誘導(dǎo)抗病機(jī)制.
　　 5.總結(jié)
　　 本研究主要的發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新：第一，鑒定了煙草上參與清除活性氧和抗病功能的Nt TRXh，并對(duì)它的活性和功能域進(jìn)行了分析；第二，研究了NtTRXh在植物體內(nèi)的功能，發(fā)現(xiàn)它可以消除活性氧，增強(qiáng)抗病性，而且抑制了植

14、物的生長(zhǎng)；第三，通過(guò)免疫學(xué)方法證明了NtTRXh主要定位于葉綠體；第四，試驗(yàn)證明，HrpNEa可以從植物根部發(fā)揮誘導(dǎo)效應(yīng)，HrpNEa處理大白菜根部可以影響軟腐病菌在大白菜根表的侵染行為，從而提高了對(duì)軟腐病菌的抗性，揭示了植物中一種新的誘導(dǎo)抗病機(jī)制.
　　 本研究有兩個(gè)主要缺點(diǎn)：第一，在植物體內(nèi)，NtTRXh主要是通過(guò)調(diào)節(jié)一些蛋白的活性從而發(fā)揮其調(diào)控作用的，然而本研究沒(méi)能找到NtTRXh作用的目的蛋白。第二，本研究雖然明確了Hr