類黃酮調控基因AtMYB12的異源表達及其對植物抗病性的貢獻.pdf

1、生物類黃酮（bioflavonoids）是自然界存在的一大類酚類物質次生代謝產(chǎn)物，在自然界中廣泛存在并具有抗氧化、抑制脂質過氧化反應、預防心血管疾病、防癌等作用。當前滿足市場需求的途徑主要通過依賴化學方法從天然材料如銀杏葉、洋蔥、檸檬、各種中藥材等中提取。
　　本研究利用番茄果實特異性表達啟動子E4、PG、2A12驅動擬南芥中生物類黃酮的特異性調控因子AtMYB12基因在番茄中表達，獲得一系列富含類黃酮（蘆丁、山奈酚蕓香糖苷和柚皮

2、素查爾酮）的番茄轉基因株系，進一步驗證了擬南芥中生物類黃酮的特異性調控因子AtMYB12基因的功能，比較了不同啟動子驅動AtMYB12基因調控類黃酮累積的差異，為進一步利用番茄作為生物反應器生產(chǎn)類黃酮組分物質提供參考。
　　首先，本研究利用不同果實特異性啟動子驅動AtMYB12基因轉化番茄品種并研究了其調控合成類黃酮類物質的能力。采用pX6-GFP載體、高保真PCR技術，通過分步克隆策略，分別構建了植物表達載體pX6-E4::At

3、MYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12，并導入農桿菌工程菌株AGL1。通過葉盤法轉化番茄品種圣女果或俏美人，分別獲得陽性轉基因植株。高壓液相色譜(HPLC)法檢測轉基因番茄果實材料，結果顯示三個載體pX6-E4::AtMYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12的轉基因果實果皮中均可檢測到類黃酮類物質的提高，其中柚皮素查爾酮在轉基因果皮中含量顯著提高。三個不同啟動

4、子能夠導致基因表達量和轉基因番茄果實中物質的含量不同，E4啟動子能夠調控AtMYB12基因在果肉中高效表達，并引起下游參與類黃酮合成基因的上調表達，PG和2A12啟動子能夠調控AtMYB12基因在果皮中表達，同時引起下游參與類黃酮合成基因的上調表達。
　　其次，利用煙草遺傳轉化系統(tǒng)研究了其它預測類黃酮或咖啡?？崴岷铣上嚓P基因的功能。將AtMYB12基因的同源基因AtMYB11在轉入三生煙草后也起到與AtMYB12基因相同的效果，

5、提高了轉基因煙草植株中類黃酮類物質的含量，但是也同樣沒有激活下游次生代謝產(chǎn)物咖啡酰奎尼酸的合成。轉基因煙草植株中，單獨超量表達NtHCT、NtHQT、NtC3H均沒有引起下游次生代謝產(chǎn)物咖啡酰奎尼酸的合成，但是NtHQT基因的超量表達后的HPLC結果顯示轉基因煙草中蘆丁的含量有所下降，推測可能由于新的未知物質的合成而阻礙或降低了蘆丁的合成。
　　進而分析了類黃酮累積的煙草轉基因株系的抗病性狀，發(fā)現(xiàn)轉AtMYB12基因的煙草植株中由

6、于蘆丁含量的提高而導致轉基因煙草植株對煙草青枯病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌的抗性提高，但轉基因植株對供試PVY病毒株系表現(xiàn)更加敏感。轉基因煙草植株的抗病反應提高，主要是由于轉基因煙草在接種病原后抗病相關基因的迅速高效表達，從而引起植株對多種病害的抗性。而且轉基因煙草提取物的平板抑菌試驗也進一步證實了蘆丁等類黃酮物質對細菌和真菌生長具有一定的抑制效果。轉基因的番茄果實由于蘆丁含量的提高也對番茄灰霉病表現(xiàn)抗性，同時蘆丁的平板抑菌試驗進一

7、步證實了蘆丁對番茄灰霉病的抗性效果。
　　生物類黃酮作為植物的一大類次生代謝產(chǎn)物的總稱，不僅是植物生長和防御反應中所必須的，同時也對人體有非常顯著且良好的效果，我們通過栽培型小果番茄和重要經(jīng)濟作物煙草作為生物反應器生產(chǎn)類黃酮生物制品，得到具有無選擇標記的番茄新品種和高含類黃酮和咖啡?？崴岬臒煵菪缕贩N，為進行品種培育和產(chǎn)業(yè)化加工奠定基礎。同時蘆丁作為一種植物的次生代謝產(chǎn)物，可以作為煙草植株抗病反應的激發(fā)子，誘導調控煙草植株對多種病