辣椒白粉病的誘導(dǎo)抗病性及其基因分析.pdf

1、辣椒(Capsicum annuum L.)屬茄科辣椒屬植物，別名番椒、辣茄、海椒、辣角、辣子、菜椒等，在我國栽培面積約150萬hm2，栽培面積居蔬菜的第二位，消費人群高達(dá)5億。辣椒白粉病是辣椒的重要病害之一，它是由專性寄生真菌——韃靼內(nèi)絲白粉菌（Leveillula taurica(Lev.) Arn.）侵染引致。該病害是一種世界性辣椒病害，主要為害辣椒葉片，影響光合作用，也侵染果實，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低。20世紀(jì)90年代初該病開始危害嚴(yán)

2、重，現(xiàn)遍及世界各個辣椒種植區(qū)，嚴(yán)重影響了辣椒的生產(chǎn)。
　　辣椒生產(chǎn)上白粉病帶來的窘境，促使人們對控制辣椒白粉病方法進(jìn)行研究，其中最為突出的是抗病品種和誘導(dǎo)抗病性的利用。長期以來人們對辣椒白粉病的研究和探討主要集中在病菌的鑒定、分類、化學(xué)藥劑防治等方面，而在辣椒本身的抗病遺傳特性、辣椒白粉病抗病性相關(guān)基因的種類、數(shù)量及其表達(dá)調(diào)控等方面還不清楚。
　　為此，本研究利用抑制差減雜交技術(shù)：
　?。?）構(gòu)建了殼寡糖誘導(dǎo)的辣椒抗白

3、粉病早期SSH文庫；
　?。?）構(gòu)建了辣椒白粉菌侵染的辣椒早期SSH文庫。
　　對兩個文庫的序列進(jìn)行了功能注釋和分類，初步探明了殼寡糖誘導(dǎo)后辣椒早期抗白粉病基因表達(dá)情況，以及白粉菌脅迫下辣椒的早期基因表達(dá)情況，并對篩選到的抗病相關(guān)基因進(jìn)行了克隆，為從分子水平闡明辣椒的抗病機制（誘導(dǎo)抗病機制）奠定基礎(chǔ)。為進(jìn)一步深入開展白粉病的抗病機制（誘導(dǎo)抗病機制）研究及利用抗性資源進(jìn)行抗病品種選育奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、

4、以感病辣椒品種遵義朝天椒為材料，探明了殼寡糖誘導(dǎo)辣椒對白粉病的誘導(dǎo)抗病性表達(dá)規(guī)律。通過實驗結(jié)果表明：25～125μg/mL殼寡糖葉面噴霧處理辣椒植株后均有明顯的誘導(dǎo)效果，其中以50μg/mL的誘導(dǎo)效果最顯著，防效達(dá)81.27％；殼寡糖處理后，辣椒對白粉性的誘導(dǎo)抗病性表達(dá)的遲滯期為處理后1d；且殼寡糖誘發(fā)辣椒對白粉病的抗性具有系統(tǒng)性。
　　2、測定了不同處理的辣椒葉片中的防御酶活性。殼寡糖處理后的辣椒葉片均有不同程度提高，所測酶系的

5、活性，尤其是PPO、POD、PAL活性提高顯著，與殼寡糖誘導(dǎo)辣椒的抗病性呈正相關(guān)。說明辣椒對外源殼寡糖的反應(yīng)與對病原菌侵染的反應(yīng)相似，誘導(dǎo)處理可產(chǎn)生系統(tǒng)的信號，形成辣椒對白粉病的系統(tǒng)獲得性抗病性，防御酶活性的提高與誘導(dǎo)抗病性密切相關(guān)，可能直接參與了抗性的表達(dá)。同時顯示，抗性材料8058相關(guān)酶活性較感病材料提高顯著，說明防御酶活性與辣椒抗病性呈密切的正相關(guān)關(guān)系。
　　3、采用整體組織透明法和熒光染色法對殼寡糖誘導(dǎo)的辣椒抗白粉病性（及

6、8058接種白粉菌后）進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察。研究發(fā)現(xiàn)：殼寡糖和抗性材料8058不影響白粉病菌孢子萌發(fā)，也不影響附著胞的產(chǎn)生，而是有效控制了白粉菌菌絲擴展速度（包括分枝數(shù)減少），同時發(fā)現(xiàn)菌絲48h后開始侵入，可從氣孔侵入，也可直接侵入。采用整體組織透明法和熒光染色法均可獲得較好的觀察效果，但隨著接種時間的推延，熒光染色法觀察效果更理想。
　　4、以感病的遵義朝天椒（遵椒1號）為試驗材料，構(gòu)建了殼寡糖誘導(dǎo)的辣椒抗白粉病早期SSH文庫，

7、共得到189條高質(zhì)量ESTs。經(jīng)DNAStar軟件拼接后獲得67個Contigs，功能注釋和分類后發(fā)現(xiàn)，在已知功能的Unigenes中，以細(xì)胞自救與抗病防御類最多，占27％；能量和基礎(chǔ)相關(guān)的基因，占25％；蛋白質(zhì)加工和合成、細(xì)胞轉(zhuǎn)運相關(guān)基因，均占7％；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子均占3％；細(xì)胞結(jié)構(gòu)各占1％，還有25％的未知功能Unigenes，包括未知功能蛋白和在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中無顯著匹配的序列。對SSH文庫中獲得的抗病相關(guān)基因進(jìn)行了分析，推測

8、鋅指家族蛋白、AGO4、抗真菌蛋白、過氧化氫酶等參與了辣椒的主要抗病過程；過敏性反應(yīng)輔助蛋白、金屬硫蛋白等可能也在抗病過程中發(fā)揮作用。另外，陰離子轉(zhuǎn)運蛋白等大量存在，推測它們可能與過敏性壞死反應(yīng)早期的離子流有關(guān)。
　　5、構(gòu)建了辣椒白粉菌侵染的辣椒葉片早期SSH文庫，通過測序和拼接，除去冗余序列共得到518條EST序列，拼接得到90個Contigs，經(jīng)Blast比對和功能注釋、分類，發(fā)現(xiàn)在所有的Unigenes中，未知功能蛋白和B

9、lastx比對后沒有顯著匹配的序列(no match)為第一大類；占26％；細(xì)胞自救與抗病防御、能量與代謝相關(guān)的基因兩者為第二大類，均占21％；細(xì)胞轉(zhuǎn)運類占10％；細(xì)胞結(jié)構(gòu)占9％；蛋白質(zhì)合成與加工占7％；細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子均占2％。在能量和基礎(chǔ)代謝類中，參與光合作用及葉綠體結(jié)構(gòu)組成的基因最多，如葉綠素a/b結(jié)合蛋白、質(zhì)體系醛縮酶等基因出現(xiàn)的頻率較高；在抗病與防御類基因中，甲殼質(zhì)結(jié)合蛋白、非特異的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白前體（與細(xì)胞自救、死

10、亡有關(guān)）、熱激蛋白家族、抗真菌蛋白等基因均存在，此外，還發(fā)現(xiàn)一些與非生物脅迫有關(guān)的基因，如金屬硫蛋白、MLO1等；細(xì)胞轉(zhuǎn)運類基因中，轉(zhuǎn)移糖基基團蛋白基因等基因出現(xiàn)頻率較高；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因包括蛋白激酶（protein kinase 2 beta chain）等，細(xì)胞生長類基因包括延伸因子（elongation factor 1-alpha-like protein）等。
　　6、通過RACE方法，在白粉菌誘導(dǎo)的辣椒8058材料中分離

11、了Contig5的全長基因，該基因全長775bp，開放閱讀框為477bp，編碼158個氨基酸，在NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對，發(fā)現(xiàn)其與辣椒的cytoplasmic small heat shock protein classI基因同源性達(dá)到100％，期望值為1e-87，另外還與番茄病程相關(guān)蛋白（Lycopersicon esculentum PR）相似性較高，達(dá)90％以上。利用DNAstar對contig5編碼的蛋白理化

12、特性進(jìn)行分析表明：該蛋白的等電點為8.3，該蛋白12位左右有個典型的疏水性區(qū)域。利用Scan Prosite工具對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，顯示：氨基酸序列的115～125（RHYTQVVWrnS）位，141～152（FIsCNYdPvGNW）位為該蛋白家族成員特有的結(jié)構(gòu)域。
　　7、對部分抗病相關(guān)基因進(jìn)行了RT-PCR和Northern驗證，發(fā)現(xiàn)供試基因在不同時間點的表達(dá)量差異較大，但在接種辣椒白粉菌后36～48h，表達(dá)量最高，是辣椒表