黑茶藨子ribesnigruml.含cytb,5結(jié)構(gòu)域脫氫酶基因的克隆與功能研究

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文黑茶藨子（Ribes nigrum L.）含Cytb結(jié)構(gòu)域脫氫酶基因的克隆與功能研究姓名：陸萬(wàn)香申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：李名揚(yáng);胡贊民20050601西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文3 8 0 a a 位點(diǎn)處分別具有膜結(jié)合脫氫酶標(biāo)志的三個(gè)“H i s B o x ”。2 R n C y D B 的定點(diǎn)突變和嵌合基g I R n C y D C A 、R n C y D C B 的構(gòu)建對(duì)胄擰c 如蹉因

2、第1 6 0 位堿基“T ”突變?yōu)椤癈 ”，使編碼終止子的引唧A A ”突變?yōu)榫幋a“Q ”的“舊C A A ”，獲得改造后的基因R n C y D B l 。將R n C y D A 、R n C y D B尾部2 0 8 b p 序列分別與片斷R n C y D C 構(gòu)建成具有1 3 4 7 b p 完整O R F 的嵌合基因R n C y D C A 和R n C y D C B 。3 生物信息學(xué)分析分別對(duì)R n C y D A 、

3、R n C y D B l 和R n C y D C A m 進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析，根據(jù)獲得的預(yù)測(cè)信息繪制了相應(yīng)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，進(jìn)一步分析了E R 膜結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。4 外源基因在釀酒酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及其功能鑒定分別將R n C y D A 、R n C y D B l 和R n C y D C A ／B 構(gòu)建釀酒酵母表達(dá)載體，采用L i A C轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行小量酵母轉(zhuǎn)化，獲得含有各表達(dá)載體的酵母轉(zhuǎn)化子，對(duì)各轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培

4、養(yǎng)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。提取酵母產(chǎn)物中鞘J ] 日L C B 進(jìn)行氧化和甲酯化或提取酵母產(chǎn)物脂肪酸并甲酯化，利用G C ．M S 鑒定各組分變化。檢測(cè)結(jié)果顯示R n C y D A 能夠利用釀酒酵母中的植物鞘胺醇生成8 ．植物鞘胺醇，j , 正9 1 ] R n C y D A n - I “ 能具有△8 - 鞘脂脫氫酶功能。P ．n C y D C A 和R n C y D C B 均能將L A和A L A 分別轉(zhuǎn)化為G L A 和O T A ，

5、證明它們具有A 6 ．脂肪酸脫氨酶功能，而且R n C y D C B 具有[ ：I ：R n C y D C A 更高的底物轉(zhuǎn)化效率。未發(fā)現(xiàn)R n C y D B l 具有△8 一鞘脂脫氫酶或△6 ．脂肪酸脫氫酶功能。s R 丑C y a B 、R n C y D C A 、I h c y D c B 間功能差異分析分析嵌合蛋白R(shí) n C y D C A 和R n C y O C B 的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，推鋇[ [ R ．n C y D

6、 C N 域是△6 ．脂肪酸脫氫酶主要功能區(qū)域，尾部區(qū)域的嵌入，不僅可能保證脫氫酶在E R 膜上的正常定位，而且更大可能使蛋白質(zhì)各級(jí)結(jié)構(gòu)完整，從而保證嵌合蛋白具有功能。分析R n C ：y D B l 和R n C y D C B 的功能差異，推測(cè)R n C y D B 和R n C y D C B 在C y t b 5 區(qū)域與第一個(gè)“H i s B o x ”之間的結(jié)構(gòu)差異引起兩者功能差異。分析R n C y D C A 和R n C