大鼠急性脊髓損傷后垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽的表達(dá)及意義.pdf

1、研究背景:脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷,目前脊髓損傷修復(fù)的兩大難題:(1)如何預(yù)防脊髓損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡,以及如何替代已死亡的神經(jīng)細(xì)胞;(2)如何抑制損傷局部疤痕形成,創(chuàng)造適合神經(jīng)再生的微環(huán)境促進(jìn)誘導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,神經(jīng)細(xì)胞不能再生,因?yàn)槌墒斓纳窠?jīng)細(xì)胞是不能分裂的,損傷后神經(jīng)細(xì)胞只能被膠質(zhì)細(xì)胞所填充而形成膠質(zhì)瘢痕。然而,近年來的研究發(fā)現(xiàn),成年動(dòng)

2、物脊髓損傷后,可以有不同程度的恢復(fù),在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)環(huán)境下,成熟哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一些受損的神經(jīng)元的軸突能有少許再生,并能與靶細(xì)胞形成功能性的突觸聯(lián)系,而一些未成熟哺乳動(dòng)物SCI后能軸突再生和功能恢復(fù),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能促進(jìn)神經(jīng)元再生從而促進(jìn)SCI修復(fù)。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)是從羊下丘腦中分離出來的一種能夠激活

3、培養(yǎng)的大鼠垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活性的神經(jīng)肽,屬于分泌素、胰高血糖素、血管活性腸肽和生長(zhǎng)激素釋放激素家族。近年來PACAP被認(rèn)為是一種新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,目前已證實(shí)PACAP具有神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等功能,可以在神經(jīng)組織受到損傷時(shí)由肽能神經(jīng)元分泌產(chǎn)生,有助于神經(jīng)損傷組織的自身修復(fù)。而且由于PACAP分子質(zhì)量小,能夠完整地透過血腦屏障,用于中樞神經(jīng)損傷的治療具有給藥途徑方便的潛在優(yōu)勢(shì)。
　　目的:通過制備大鼠SCI模型,研究大鼠

4、脊髓損傷后PACAP表達(dá)的變化,為進(jìn)一步探索脊髓損傷后的再生修復(fù)機(jī)制和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:成年雌性SD大鼠84只,體重180~220g(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為損傷后1,3,7,14,28d組以及正常對(duì)照組(不做手術(shù)),每組14只。所有動(dòng)物在1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉后,行背中段正中切口,范圍 T9~11,采用改良 NYU撞擊裝置,撞擊T10節(jié)段制備大鼠中度SCI模型,于術(shù)后

5、1、3、7、14、28d取材,制作石蠟組織切片行HE染色及PACAP免疫組化染色(n=5),制作電鏡超薄切片透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)變化及PACAP的細(xì)胞定位(n=3),提取損傷脊髓組織總RNA及總蛋白采用RT-PCR(n=3)和western blot(n=3)方法對(duì)脊髓組織中PACAP mRNA及蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行半定量觀察。
　　結(jié)果:1.脊髓損傷區(qū)的組織病理學(xué)改變:光鏡下見損傷后大鼠脊髓灰質(zhì)有大片壞死及出血壞死后形成的囊腔

6、,神經(jīng)細(xì)胞腫脹、部分神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核固縮,白質(zhì)疏松水腫,空泡變性,部分神經(jīng)纖維溶解消失,炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)有所好轉(zhuǎn)。
　　2.免疫組織化學(xué)觀察:PACAP陽性反應(yīng)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,對(duì)照組神經(jīng)元中有少量PACAP陽性表達(dá),損傷后PACAP的表達(dá)逐漸增高,損傷7d時(shí)PACAP表達(dá)明顯增加(P<0.05),至28d時(shí)表達(dá)仍較高。
　　3.RT-PCR和western blot檢測(cè):在蛋白和mRNA水平PACAP表

7、達(dá)趨勢(shì)一致,正常對(duì)照組可見PACAP mRNA和蛋白的少量表達(dá),脊髓損傷后1d表達(dá)開始增加,7d時(shí)表達(dá)明顯增加,與3 d時(shí)比較差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　4.透射電鏡及免疫電鏡觀察:SCI后脊髓髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解,軸索中微絲、微管排列不整或消失,神經(jīng)元細(xì)胞膜、核膜不整齊,游離核糖體增多,線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈不同程度的腫脹、空泡變性,嵴溶解斷裂。膠體金標(biāo)記免疫電鏡觀察顯示SCI后1d PACAP抗原位于神經(jīng)元胞漿及部分神經(jīng)