癲癇患者發(fā)作后血清腺苷酸酶活性的動態(tài)變化的研究.pdf

1、背景：癲癇是神經系統(tǒng)常見的急癥、重癥之一，全球有數(shù)千萬的癲癇病人，反復的癲癇發(fā)作給個人、家庭、社會帶來沉重的經濟和心理負擔。近年來，癲癇的病因、發(fā)病機制、病理和治療等許多方面的研究已經取得了很大進展，但癲癇發(fā)作具體發(fā)病機制尚未完全闡明，每次癲癇發(fā)作起始與終止的內在機制具體不清。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腺苷系統(tǒng)是腦內重要的抗癲癇和腦保護系統(tǒng)。腺苷系統(tǒng)通過腺苷與G蛋白偶聯(lián)腺苷受體的相互作用在腦內發(fā)揮重要的神經抑制作用，急性癲癇發(fā)作后腺苷水平急劇增

2、高，終止發(fā)作，因此腺苷系統(tǒng)被稱為“內源性抗癲癇系統(tǒng)”，成為癲癇研究新的熱點。腺苷酸如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)及其衍生物腺苷(adenosine，ADO)在一些生理和病理過程中都是重要的信號分子。研究證明，腺苷是一個有效的抗驚厥劑，并具有神經保護特性。研究證實，給予

3、致驚厥藥物后，在癲癇發(fā)作問期和發(fā)作期間大鼠海馬內腺苷釋放明顯增加。腺苷和腺苷A1受體激動劑能明顯地保護急性給予戊四氮的大鼠，避免癇性發(fā)作。這些都提示內源性腺苷具有神經保護和抗驚厥的作用。而且實驗性癲癇發(fā)作使腦內腺苷水平升高，在許多病理情況下，與人類循環(huán)血漿腺苷濃度迅速升高有關。腺苷主要由腺苷酸酶水解腺苷酸而產生。腺苷酸酶能錨定在細胞膜上，在體液中是可溶性的。這些酶包括：⑴三磷酸腺苷二磷酸水解酶家族；⑵腺苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族；⑶5’

4、-末端核苷酸酶。人類血清水解腺苷酸的能力依賴于循環(huán)中可溶性核苷酸酶的存在。ATP通過可溶性磷酸二酯酶作用首先地轉換成AMP和無機焦磷酸。相反ADP通過三磷酸腺苷二磷酸水解酶優(yōu)先地轉換成AMP和無機磷酸。最后AMP通過可溶性5’-核苷酸酶水解成腺苷。腺苷主要通過激活高親和力抑制性腺苷A1受體和興奮性腺苷A2受體來發(fā)揮作用。腺苷酸酶控制腺苷酸和腺苷酸受體配體的有效性。在戊四氮誘導的大鼠癲癇發(fā)作產生了腺苷酸水解的變化。Bonan等研究證實，在

5、匹魯卡品和紅藻氨酸點燃的癲癇大鼠模型的海馬和腦皮質的突觸小體內，ATP二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性升高。在注射戊四氮誘導單次驚厥的大鼠和進行戊四氮點燃誘導癲癇發(fā)作的大鼠血清ATP、ADP和AMP水解率顯著增加，證明三磷酸腺苷二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性的顯著升高，提示血清核苷酸酶途徑的刺激可能在減弱癲癇發(fā)作事件中起一定作用。目前有關癲癇患者發(fā)作后腺苷酸酶活性的動態(tài)變化的研究甚少。目前，磷酸-硝基酚-5’-一磷酸胸苷(p-nitr

6、ophenil-5’-thymidine monophosphate，p-Nph-5'-TPM)已經被用為磷酸二酯酶的人工底物，產生磷酸-硝基酚。現(xiàn)通過測定癲癇患者血清ATP、ADP、AMP水解率和可溶性磷酸二酯酶活性的動態(tài)變化，進一步探討腺苷酸酶在癲癇發(fā)作過程中的調節(jié)機制。本研究分兩部分：
　　 第一部分：癲癇患者發(fā)作后血清ATP、ADP、AMP水解率的動態(tài)變化。
　　 目的：研究癲癇患者發(fā)作后各時間點ATP、ADP和

7、AMP水解率的動態(tài)變化及其臨床意義，探討ATP、ADP和AMP水解對癲癇發(fā)作過程的調節(jié)機制。
　　 方法：⑴研究對象系我院神經內科2008年06月至2009年10月住院的癲癇患者30例，其中男17例，女13例；年齡12～63歲，平均(30.6±11.2)歲；病程2～31年，平均病程(9±3.8)年。所有患者均行24h視頻腦電圖檢查，監(jiān)測癇性發(fā)作的臨床電生理特點，并行顱腦磁共振(magnetic resonance imaging

8、，MRI)檢查。所有患者依據(jù)國際抗癲癇聯(lián)盟癲癇發(fā)作分類標準(InternationalLeague Against Epilepsy，ILAE，1981)進行分類，12例患者為全面性強直陣攣性發(fā)作，18例患者為復雜部分性發(fā)作。排除神經系統(tǒng)進行性加重疾病、代謝性疾病、心血管疾病。11例患者在抗癲癇藥物單藥治療，19例患者在聯(lián)合治療中(平均應用藥物數(shù)目2種)。(2)正常對照組：20人，均來源于我院門診健康查體者，無癲癇、神經系統(tǒng)疾病及心血管

9、疾病。其中男11人，女9人，年齡20～50歲，平均(28.3±7.86)歲。兩組在性別、年齡方面無統(tǒng)計學意義。⑵標本采集兩組于早晨抽取空腹肘靜脈血，均于抽血前1 h內安靜臥床休息。癲癇患者于肘靜脈處置靜脈留置針。癲癇組患者抽血樣前12 h內無癇性發(fā)作，于癇性發(fā)作后5min，10min，20min，30min，60min和10h再抽取血樣。所有血樣室溫靜置30～60 min，4℃下離心3000 r/min15 min，取上層血清置于Epp

10、endorf管，-70℃冰箱保存待測。⑶ATP、ADP、AMP水解率的測定按Bruno等報道進行ATP、ADP、AMP水解率的測定。含有5 mmol/L CaCl2和44 mmol/L Tris-HCl溶液共175 ul，pH值調節(jié)為8.0(測定AMP水解時pH7.2)。加入5 ul血清，在37℃下預孵育10min。加入10 ul ATP或ADP或AMP，最終達到1.0mmol/L的反應濃度，37℃下孵育10 min。加入200 ul1

11、0％三氯醋酸終止反應。630 nm處測定吸光度。所有血樣均測定三次。酶活性用每分鐘每毫升血清釋放的無機磷酸鹽量(nmol)表示。
　　 結果：①所有患者中24例24小時視頻腦電圖檢查檢測到尖波或棘波或尖慢綜合波或棘慢綜合波或多棘慢綜合波或多棘波，6例未檢測到癲癇樣放電波。頭顱MILI檢查有13例檢出異常，包括顱內占位、顱內軟化灶、腦萎縮、海馬硬化等。30例病人中，3例有顱內感染史，2例有腦血管病史，2例有顱腦外傷史，1例有腦萎縮

12、史，1例有顱腦手術史。②與正常對照組相比，癲癇組發(fā)作間期ATP、ADP和AMP的水解率差異無統(tǒng)計學意義，癲癇發(fā)作后ATP、ADP和AMP的水解率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③與正常對照組相比，癲癇組發(fā)作后5 min，ATP水解率顯著升高，20 min達高峰，60 min時仍保持高水平，10 h后恢復至基線水平。④與正常對照組相比，癲癇組癲癇發(fā)作后5 min，ADP和AMP的水解率顯著升高達高峰，一直增高至30 min，6

13、0 min時ADP的水解率恢復至基線水平，而AMP水解率較正常對照組明顯下降，10 h恢復至基線水平。ADP大部分與AMP水解變化相一致。
　　 結論：⑴癲癇發(fā)作間期，ATP、ADP和AMP的水解率未見明顯升高。⑵癲癇患者發(fā)作后，ATP、ADP和AMP的水解率明顯升高。⑶ADP與AMP水解變化大部分相一致。⑷癲癇發(fā)作后可能存在腺苷酸酶活性升高，腺苷酸酶活性增高可能參與了癲癇發(fā)作終止的調節(jié)機制。
　　 第二部分：癲癇患者發(fā)

14、作后血清可溶性磷酸二酯酶活性的動態(tài)變化。
　　 目的：研究癲癇患者發(fā)作后各時間點可溶性磷酸二酯酶活性的動態(tài)變化及其臨床意義，探討腺苷酸酶對癲癇發(fā)作過程的調節(jié)機制。
　　 方法：⑴選擇癲癇患者30例和正常對照者20人，12例患者為全面性強直陣攣性發(fā)作，18例患者為復雜部分性發(fā)作。⑵兩組于早晨抽取空腹肘靜脈血，癲癇組于癲癇發(fā)作后5 min、10 min、20min、30 min、60 min和10 h抽取肘靜脈血，取血清，-

15、70℃冰箱保存待測。⑶.磷酸二酯酶活性測定按Bruno等報道進行磷酸二酯酶活性測定。含有0.5 mmol/L p-Nph-5'-TPM和40 mmol/L Tris-HCL溶液共230 ul，調節(jié)pH值至8.9。37℃預孵育10 min。加入20 ul血清開始反應，37℃孵育10 min。加入750ul0.2 mol/L NaOH終止反應。在400 nm吸光度處測定磷酸.硝基酚的量。酶活性用每分鐘每毫升血清釋放的磷酸.硝基酚量(nmol

16、)表示。⑷應用OLYMPUS AU600全自動生化分析儀檢測癲癇組和正常對照組血清樣本中LDH活性。
　　 結果：①與正常對照組相比，癲癇組發(fā)作間期血清可溶性磷酸二酯酶活性差異無統(tǒng)計學意義，癲癇發(fā)作后較對照組諸項明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②與正常對照組相比，癲癇組發(fā)作后5 min，血清可溶性磷酸二酯酶活性顯著升高，20 min達高峰，60 min時仍保持高水平，10 h后恢復至基線水平；癲癇發(fā)作后磷酸二酯酶活性