腺苷酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)脆性X智力低下一號封閉基因重新表達(dá)的初步研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文腺苷酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)脆性X智力低下一號封閉基因重新表達(dá)的初步研究姓名：周杏申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：姚英民20070601中文摘要我們前期研究了FMRl基因封閉后對cAMP代謝過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶一一腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase，AC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性的影響，在國內(nèi)外首次提出，腺苷酸環(huán)化酶活性抑制可能是Fra(X)患者細(xì)胞內(nèi)cAMP水平

2、降低的主要原因。本研究試圖采用腺苷酸環(huán)化酶激活劑提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，初步探討該藥物重新激活封閉FMRl基因的可能性；初步比較腺苷酸環(huán)化酶激活劑、去甲基化藥物、促組蛋白乙?；幬镎T導(dǎo)封閉FMRl基因重新活化的效果，旨在為應(yīng)用提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的藥物誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MRl基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，為Fra(X)患者治療探索一種新的思路和新的治療方法。研究方法：l、采用硝普鈉(sodiumnilroprusside，SNP)封閉FMRI基因，制作外

3、周血單個(gè)核細(xì)胞和PCI2神經(jīng)細(xì)胞FMRl基因封閉的細(xì)胞模型：硝普鈉可誘導(dǎo)FMRl啟動子的高度甲基化，阻斷轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，從而抑制了FMRlmRNA的轉(zhuǎn)錄。PCI2細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤原代細(xì)胞，已用于構(gòu)建多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型。在PBMC細(xì)胞模型中給予硝普鈉500umol／L，PCI2細(xì)胞模型中給予硝普鈉為1000umol／L，48小時(shí)內(nèi)更換新鮮配制的硝普鈉藥物。通過RTPCR觀察FMRI基因的封閉情況。2、腺苷酸環(huán)化酶

4、特異性激活劑弗司可林(forskolin，F(xiàn)SK)誘導(dǎo)FMRI基因封閉的重新表達(dá)：以上述建立的Fra(x)細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，在給予硝普鈉封閉FMRl后第1211分別向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加弗司可林，繼以在弗司可林作用滿24h后收集細(xì)胞，提取RNA，通過RTPCR檢測FMRl基因的重新活化情況。3、在PBMC細(xì)胞模型中，三類藥物對FMRl封閉基因誘導(dǎo)作用的比較：在PBMC建立的Fra(x)細(xì)胞模型中，于硝普鈉封閉FMRl第12h后，分別加入弗司可