羅伯茨綠僵菌類膠原蛋白基因(Mcl2)的功能研究.pdf

1、昆蟲病原真菌廣泛用于農(nóng)林害蟲的防治，由于其環(huán)境安全性、強致病性以及潛在的流行性，成為很有應(yīng)用潛力的生物制劑。羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robberstii)作為一種昆蟲病原菌的模式生物，一直在昆蟲病原真菌的遺傳調(diào)節(jié)機制、致病機制及生物防治方面的研究中走在前列。類膠原蛋白(collagen-like protein)基因存在于病毒、細(xì)菌和真核生物內(nèi)，在調(diào)控生物生長發(fā)育、代謝途徑和致病性等方面發(fā)揮重要作用。本實驗室的前期研究表明

2、，分析熱激處理的綠僵菌孢子轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，在所有上調(diào)的基因中，一種類膠原蛋白的基因表達(dá)上調(diào)幅度位居前三，我們推測類膠原蛋白可能在綠僵菌的抗逆過程起著較為重要的作用。為此，本文對羅伯茨綠僵菌內(nèi)類膠原蛋白基因(Mcl2)的功能進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，意在闡明Mcl2的遺傳信息，并明確該基因在抗逆、生長發(fā)育以及殺蟲能力等方面的作用，為人工創(chuàng)制高效殺蟲轉(zhuǎn)基因綠僵菌菌株提供新基因儲備。
　　本研究首先對綠僵菌類膠原蛋白基因克隆注釋，獲得Mcl2

3、遺傳信息；其次利用同源重組的原理，運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得該基因的敲除菌株及回補菌株。最后，通過對野生型菌株、敲除突變體菌株和回補突變體菌株表型的分析，獲得Mcl2功能特征。具體的研究結(jié)果如下：
　　(1)通過RACE克隆與測序方法，得到了Mcl2的cDNA全長序列，并對其進(jìn)行生物學(xué)信息注釋，而且通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明本研究的這種羅伯茨綠僵菌基因(Mcl2)可能是一種新

4、的類膠原蛋白基因。
　　(2)通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pDHt-SK-Mcl2L-BAR-Mcl2R和pDHt-SK-Mcl2-BEN，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和同源重組基因敲除的方法，最后成功得到?Mcl2（敲除突變體）和?Mcl2/Mcl2（回補突變體）。
　　(3)比較WT（野生型菌株）、?Mcl2（敲除突變體）和?Mcl2/Mcl2（回補突變體）之間的生物學(xué)性狀表明：在PPDA、PDA、SDAY和1/4SDAY培養(yǎng)基上，敲除突變體的

5、菌落顏色和形態(tài)、菌絲生長速度與野生型菌株相比均無顯著差異；而SDAY、1/4SDAY、PPDA及PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量略低于野生型菌株，分別為下降了8.34％、9.27%、8.45%和9.89%，?Mcl2/Mcl2與WT的產(chǎn)孢量基本一致。
　　(4)對上述3個菌株的逆境脅迫分析表明：它們的分生孢子38°C熱激處理2 h，發(fā)現(xiàn)敲除Mcl2后，其分生孢子的萌發(fā)率降為40.19%，與野生型菌株相比降低了34.79%，表明缺失Mcl2的菌

6、株對外界溫度的變化更敏感。而對分生孢子紫外照射3 min，敲除菌株分生孢子萌發(fā)率為56.48%，較野生型菌株和回補菌株分別減少9.45%和9.10%，并沒有明顯變化。在化學(xué)試劑脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，在加入多菌靈、H2O2、SDS、Congo Red等不同化學(xué)物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基中，敲除突變體的生長狀況與野生型亦無明顯差異。
　　(5)用這3種不同菌株的分生孢子(107 conidia/mL)侵染大蠟螟，與野生型綠僵菌相比，敲除了Mcl2的