花生(arachishypogaeal.)膜聯(lián)蛋白基因annahs的克隆及功能分析

1、分類號(hào)： 墨5 魚三：2密 級(jí)： 公玨單位代碼：學(xué) 號(hào)：花生( A r a c h i s h y p o g a e a L ．)．地Q 墨魚2 0 1 3 1 1 0 0 0 1 7膜聯(lián)蛋白基因A n n A h s 的克隆及功能分析M o l e c u l a rC l o n i n g a n d F u n c t i o n a l A n a l y s i s o n A n n e x i nG e n e s A

2、 n n A h s i nP e a n u t a r a c h i s h y p o g a e a L ．)學(xué)位申請(qǐng)人：何美敬指導(dǎo)教師：劉立峰教授學(xué)科專業(yè)：作物遺傳育種學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士授予單位：；．- I j L 農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一六年五月三十一日摘要近年來，干旱和鹽脅迫己成為影響作物產(chǎn)量與品質(zhì)的重要限制因素。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來越多的干旱及鹽脅迫應(yīng)答基因被發(fā)現(xiàn)?；ㄉ俏覈钪匾挠土献魑镏?，其總產(chǎn)量

3、約占我國油料作物的4 9 ％。花生的抗旱耐鹽研究相對(duì)較少，僅有少量基因和轉(zhuǎn)錄因子被克隆。因此，發(fā)掘花生逆境相關(guān)基因，明確花生逆境基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理對(duì)花生抗逆育種具有重要意義。膜聯(lián)蛋白( A n n e x i n ) 是一類依賴C a 2 + 或者磷脂結(jié)合的多功能蛋白，在生物體內(nèi)通常以多基因家族形式存在。高等植物膜聯(lián)蛋白廣泛分布在植物生長和發(fā)育的各個(gè)組織，并參與多種生理進(jìn)程，如膜建成、細(xì)胞生長、豆科作物的根瘤形成以及果實(shí)成熟等。許多研究已

4、表明膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、細(xì)胞分泌過程以及植物響應(yīng)逆境中起著重要作用?；谀ぢ?lián)蛋白的功能，本研究將膜聯(lián)蛋白基因作為花生抗逆研究的候選基因，通過同源克隆的方法，從抗逆、廣適花生品種冀花2 號(hào)葉片中分離了膜聯(lián)蛋白基因A n n A h s ，利用熒光實(shí)時(shí)定量分析了不同處理及不同組織中A n n A h s 的表達(dá)特性，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，主要研究結(jié)果如下：1 ．A n n A h s 基因的克隆及序列分析：克隆到花

5、生中6 個(gè)不同全長和2 個(gè)部分序列的新膜聯(lián)蛋白基因A n n A h s ，命名為A n n A h l ，A n n A h 2 ，A n n A h 3 ，A n n A h 5 ，A n n A h 6 ，A n n A h 7 ，A n n A h 4 并[ 1 A n n A h 8 ( 基因登錄號(hào)分別為K M 2 6 7 6 4 3 ，K M 2 7 6 7 7 9 ，K M 2 7 6 7 8 0 ，K M 2 7 6 7

6、 8 1 ，K M 2 7 6 7 8 2 ，K M 2 7 6 7 8 3 ，K M 2 7 6 7 8 4 和K M 2 7 6 7 8 5 ) 。A n n A M ，A n n A h 2 ，A n n A h 3 ，A n n A h 5 ，A n n A h 6 年r l A n n A h 7 的開放閱讀框分別為9 5 1b p ，9 5 4 b p ，9 6 6 b p ，9 4 8 b p ，9 4 8 b p 和1

7、0 0 2b p 。在核苷酸水平上，A n n A h s 的編碼區(qū)域相似一致性為4 6 ．2 3 ．6 6 ．5 6 ％，相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的同源性在1 7 ．9 3 ．6 5 ．7 2 ％之間。所有預(yù)測的A N N A h s 蛋白的分子量在3 5 ．8 5 ．3 6 ．2 9 K D 之問，但是推斷的等電點(diǎn)差異較大為5 ．9 7 ．8 ．8 1 。推測的A N N A h s 具有a n n e x i n 家族典型的特征，即A

8、N N A h s 在第一或者第四個(gè)重復(fù)單元中包含典型的t y p e l IC a 2 + - b i n d i n gs i t e ( G —X —G —T 一( 3 8 ) - D ／E ) 以及S 3c l u s t e r s 等保守的殘基／元件。除A N N A h 7外，其他5 個(gè)A N N A h s N 末端區(qū)域具有保守的H i s 殘基。2 ．A N N A h s 序列的進(jìn)化分析：系統(tǒng)發(fā)育樹表明A N N A

9、 h s 被區(qū)分在不同的組間，并與同組內(nèi)的豆科作物親緣關(guān)系最近，除A N N A h 2 與擬南芥的親緣關(guān)系近外，其他成員與擬南芥、玉米的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同組內(nèi)的a n n e x i n s 保守m o t i f s 模式一致。3 ．A n n A h s 基因組序列的克隆和序列分析：擴(kuò)增至J J A n n A h s 基因組序列和啟動(dòng)子區(qū)域。A n n A h s 基因外顯子和內(nèi)含子剪接位點(diǎn)剪接方式符合經(jīng)典的G T —A G 規(guī)律

10、。同一組中花生和豆科作物的a n n e x i n 基因組外顯子．內(nèi)含子組織具有相似的分布( 第一個(gè)內(nèi)含子的位相為1 ，其他位相為0 ) ，且a n n e x i n 相對(duì)應(yīng)的外顯子長度具有一致性。啟動(dòng)子預(yù)測分析表明，A n n A h s 啟動(dòng)子元件含有典型的T A T A —b o x 、C A A T ．b o x ；f l l 一系列光響應(yīng)元件G —b o x ，b o x 4 和S P l 等，但是一些重要的調(diào)控元件，S