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文檔簡介
1、蓖麻毒蛋白是一種核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIPs)，由A、B兩條鏈組成，其中A鏈為效應(yīng)鏈。本試驗以蓖麻毒蛋白A鏈基因為模板，設(shè)計并構(gòu)建含有RTA基因的RNAi雙元表達(dá)載體，以期在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出含有RTA基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，發(fā)揮干擾RTA蛋白表達(dá)的作用，使蓖麻的脫毒提高到分子水平。
1.根據(jù)GenBank中發(fā)布的RTA基因序列設(shè)計了兩對引物，引物兩端分別插入不同的酶切位點
2、。通過降落PCR擴(kuò)增出兩條長度為785bp的相同片段不同方向的蓖麻毒蛋白A鏈基因，將其分別命名為RTA-S和RTA-AS,將RTA-S和RTA-AS進(jìn)行TA克隆，并將通過PCR鑒定和雙酶切鑒定的克隆分別命名為pMD-RTA-S和pMD-RTA-AS。對pMD-RTA-S和pMD-RTA-AS芋列測定后與GenBank中RTA基因核苷酸芋列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明擴(kuò)增出的RTA基因與已知RTA序列同源性分別為97.95％和97.96％。<
3、br> 2.雙酶切pMD-RTA-AS與中間載體pHANNIBAL后將RTA-AS因片段與中間載體pHANNIBAL大片段連接，菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定正確的克隆命名為pHAN-RTA-AS。雙酶切pHAN-RTA-AS與pMD-RTA-S回收并連接相應(yīng)片段，將菌落PCR鑒定雙酶切鑒定正確的克隆命名為pHAN-RTA-AS-S。雙酶切pBI-121和pHAN-RTA-AS-S.回收相應(yīng)片段、連接構(gòu)建RNAi雙元表達(dá)載體，
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