MSTN基因RNAi雙元素表達(dá)載體構(gòu)建及效果研究.pdf

1、肌肉生成抑制素基因(myostatin，MSTN)，又稱生長(zhǎng)分化因子-8(GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員之一，最初從小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)克隆得到。MSTN基因“敲除”的超級(jí)鼠及雙肌牛的研究證明該基因是骨骼肌發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。 RNA干擾(RNAi)是近幾年發(fā)現(xiàn)的在自然界廣泛存在的由dsRNA介導(dǎo)的特異性阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。目前已經(jīng)成為一種新的研究特定基因功能的技術(shù)手段。

2、 本試驗(yàn)以雞為作為動(dòng)物模型，研究MSTN調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了含有MSTN的RNAi雙元表達(dá)載體pEGFP-N1-MSTN<,1>-MSTN<,2>，以在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出含有MSTN基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，發(fā)揮干擾MSTN蛋白表達(dá)的作用。 試驗(yàn)Ⅰ利用BLAST 2 SEQUENCE軟件將本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擴(kuò)增出的大骨雞肌肉組織myostatin基因全部cDNA序列與GenBank中myostatin基因進(jìn)行同源性比對(duì)，

3、找到其保守序列，然后利用primer primer 5.0程序自行設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，按照5’端所加酶切位點(diǎn)的不同，由(大連)寶生物公司合成兩對(duì)引物。通過(guò)PCR擴(kuò)增出兩條長(zhǎng)度均為393bp的相同DNA片段，將其分別命名為MSTN-1和MSTN-2。將MSTN-1和MSTN-2進(jìn)行TA克隆，并將通過(guò)菌落PCR和單、雙酶切鑒定的克隆分別命名為pMD-MSTN-1和pEGM-MSTN-2。對(duì)pMD-MSTN-1和pEGM-MSTN-2序列測(cè)定后與

4、GenBank中myostatin基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明擴(kuò)增出的大骨雞肌肉組織myostatin基因核苷酸序列同已知myostatin序列同源性為100％。雙酶切pMD-MSTN-1與中間載體pHANNIBAL后將MSTN-1與中間載體pHANNIBAL連接，雙酶切鑒定，將鑒定正確的克隆命名為pHAN-MSTN<,1>。雙酶切pHAN-MSTN<,1>與pEGM-MSTN-2后回收并連接相應(yīng)片斷，雙酶切鑒定，將鑒定正確的

5、克隆命名為pHAN-MSTN<,1>-MSTN<,2>。雙酶切pEGFP-N1和pHAN-MSTN<,1>-MSTN<,2>，回收相應(yīng)片斷、連接構(gòu)建RNAi雙元表達(dá)載體，將單、雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-MSTN<,1>-MSTN<,2>，即為myostatin基因的RNAi雙元表達(dá)載體。 試驗(yàn)Ⅱ利用脂質(zhì)體成功地將構(gòu)建好的pEGFP-N1-MSTN<,1>-MSTN<,2>轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞中，觀察成