蓖麻GA20-ox基因表達(dá)分析及RNAi載體轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，蓖麻種植產(chǎn)業(yè)已具有向種植矮化品種栽培方式發(fā)展的趨勢(shì)。矮化后的蓖麻具有在同等條件下比高稈蓖麻更強(qiáng)的節(jié)水、抗旱、抗倒伏、利于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化收割等優(yōu)勢(shì)，因此，蓖麻矮化育種已成為蓖麻育種的熱點(diǎn)之一。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，植物激素赤霉素(GA)參與莖稈節(jié)間的發(fā)育過程，從而影響植株的高度。赤霉素20氧化酶（GA20-oxidase）是植物赤霉素生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，決定具有生物活性GAs的合成量。本文克隆并初步研究了蓖麻中的GA

2、-20氧化酶基因，為蓖麻矮化育種提供參考。
　　本研究利用同源基因克隆法，克隆了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的蓖麻GA-20氧化酶基因的堿基序列(XM_002510827.1)，通過生物信息學(xué)軟件對(duì)其基因序列進(jìn)行分析，表明克隆得到的是目的基因，記為RcGA20-ox。利用RT-PCR技術(shù)，分析了GA20-氧化酶基因在蓖麻不同器官的表達(dá)量，表明RcGA20-ox基因在蓖麻種子和嫩葉中表達(dá)量最高。利用RT-qPCR技術(shù)，對(duì)RcGA20-ox基

3、因在典型的“蓖綠2號(hào)”、“稼祥2號(hào)”、“CSR24.181”、“浙蓖17號(hào)”四種高稈和“中北4號(hào)”、“中北5號(hào)”、“天蓖26號(hào)”、“浙蓖36號(hào)”四種矮稈蓖麻品種不同時(shí)期嫩葉中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，表明RcGA20-ox基因的表達(dá)差異，是影響植株表現(xiàn)高矮的重要原因之一。
　　以蓖麻的cDNA和中間載體pHANNIBAL為模板，分別擴(kuò)增得到正向片段、反向片段、內(nèi)含子片段，分別記為GA20s、GA20a、Intron。使用XbaⅠ和Sa

4、cⅠ酶切載體pBI121，利用In-Fusion技術(shù)，將線性載體與三個(gè)PCR片段進(jìn)行連接，構(gòu)建了RNA干擾載體pBI-GA20ox-RNAi。利用DNA凍融法，將干擾載體pBI-GA20ox-RNAi轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，成功制備了用于侵染的農(nóng)桿菌工程菌液。
　　對(duì)蓖麻高效再生體系的重要步驟進(jìn)行了優(yōu)化，采用分子水平評(píng)價(jià)機(jī)制，以LEC1基因的表達(dá)與再生體系實(shí)際出芽效率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5m

5、g/L6-BA+0.2mg/L IBA;研究GA3濃度對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響，確定了不定芽最適伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.1mg/L GA3。通過以上條件優(yōu)化，誘導(dǎo)生根后發(fā)育成完整的蓖麻植株并移栽成活。
　　應(yīng)用自主構(gòu)建的蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用真空輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，使用攜帶RNA干擾載體的農(nóng)桿菌對(duì)蓖麻胚尖進(jìn)行侵染，篩選得到抗性植株16個(gè)，其概率為3.05％。通過PCR檢測(cè)，得到蓖麻轉(zhuǎn)