蓖麻GA20-ox基因表達分析及RNAi載體轉化的初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代農業(yè)經濟的發(fā)展，蓖麻種植產業(yè)已具有向種植矮化品種栽培方式發(fā)展的趨勢。矮化后的蓖麻具有在同等條件下比高稈蓖麻更強的節(jié)水、抗旱、抗倒伏、利于實現(xiàn)機械化收割等優(yōu)勢，因此，蓖麻矮化育種已成為蓖麻育種的熱點之一。在植物生長發(fā)育過程中，植物激素赤霉素(GA)參與莖稈節(jié)間的發(fā)育過程，從而影響植株的高度。赤霉素20氧化酶（GA20-oxidase）是植物赤霉素生物合成的關鍵調節(jié)酶，決定具有生物活性GAs的合成量。本文克隆并初步研究了蓖麻中的GA

2、-20氧化酶基因，為蓖麻矮化育種提供參考。
　　本研究利用同源基因克隆法，克隆了NCBI數(shù)據庫已公布的蓖麻GA-20氧化酶基因的堿基序列(XM_002510827.1)，通過生物信息學軟件對其基因序列進行分析，表明克隆得到的是目的基因，記為RcGA20-ox。利用RT-PCR技術，分析了GA20-氧化酶基因在蓖麻不同器官的表達量，表明RcGA20-ox基因在蓖麻種子和嫩葉中表達量最高。利用RT-qPCR技術，對RcGA20-ox基

3、因在典型的“蓖綠2號”、“稼祥2號”、“CSR24.181”、“浙蓖17號”四種高稈和“中北4號”、“中北5號”、“天蓖26號”、“浙蓖36號”四種矮稈蓖麻品種不同時期嫩葉中的表達情況進行了分析，表明RcGA20-ox基因的表達差異，是影響植株表現(xiàn)高矮的重要原因之一。
　　以蓖麻的cDNA和中間載體pHANNIBAL為模板，分別擴增得到正向片段、反向片段、內含子片段，分別記為GA20s、GA20a、Intron。使用XbaⅠ和Sa

4、cⅠ酶切載體pBI121，利用In-Fusion技術，將線性載體與三個PCR片段進行連接，構建了RNA干擾載體pBI-GA20ox-RNAi。利用DNA凍融法，將干擾載體pBI-GA20ox-RNAi轉入農桿菌EHA105中，成功制備了用于侵染的農桿菌工程菌液。
　　對蓖麻高效再生體系的重要步驟進行了優(yōu)化，采用分子水平評價機制，以LEC1基因的表達與再生體系實際出芽效率作為評價指標，確定了不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5m

5、g/L6-BA+0.2mg/L IBA;研究GA3濃度對不定芽伸長的影響，確定了不定芽最適伸長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.1mg/L GA3。通過以上條件優(yōu)化，誘導生根后發(fā)育成完整的蓖麻植株并移栽成活。
　　應用自主構建的蓖麻遺傳轉化體系，利用真空輔助農桿菌介導轉化法，使用攜帶RNA干擾載體的農桿菌對蓖麻胚尖進行侵染，篩選得到抗性植株16個，其概率為3.05％。通過PCR檢測，得到蓖麻轉