應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告載體研究上游開放閱讀框的突變對靶基因的影響.pdf

1、目的：
　　對于人類多種疾病的變化與uORF之間關(guān)系尚無系統(tǒng)性的研究，為此，在前期應(yīng)用生物信息學(xué)的手段對幾個(gè)現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫中人類基因轉(zhuǎn)錄本上uORF進(jìn)行研究，通過數(shù)據(jù)過濾、篩選、GO功能注釋和Kozak序列特征的分析，以及ClinVar、TCGA、COSMIC三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫分析的基礎(chǔ)上，在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌病人的突變基因中隨機(jī)挑選出高度懷疑蛋白表達(dá)的改變與uORF密切相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2、我們希望通過這項(xiàng)研究，讓更多的研究者關(guān)注人類疾病與uORF的關(guān)系，有助于理解疾病的表型與基因型的關(guān)系，為研究疾病發(fā)生的機(jī)制提供新的思路，也為疾病的臨床治療提供新的方向。
　　方法：
　　1.在前期生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上的研究
　　我們利用現(xiàn)有的refGene、Genebank等數(shù)據(jù)庫計(jì)算并注釋出所有經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的基因的5' UTR的起始和終止坐標(biāo)并提取其序列，經(jīng)過一致性校對，篩選出兩套數(shù)據(jù)集中完整性和一致性高的序列條

3、目，然后掃描含有uORF的轉(zhuǎn)錄本及其對應(yīng)的基因名。對遴選出來含有uORF的基因進(jìn)行GO功能注釋與富集，對翻譯起始位點(diǎn)(translation initiation site，TIS)和uAUG周圍的序列進(jìn)行Kozak文本序列分析。最后，通過對ClinVar、TCGA、COSMIC三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫分析隨機(jī)挑選出GCSAM、 PSTPIP1、HIS1H2BD、CEBPB、VAT1、ERP29六個(gè)高度懷疑基因表達(dá)與uORF序列突變密切相關(guān)的靶點(diǎn)

4、基因，并從蛋白表達(dá)與mRNA轉(zhuǎn)錄這兩個(gè)方面來進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　選擇psiCHECKTM-2雙熒光素酶報(bào)告載體作為細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的載體，但是該載體只有一個(gè)多克隆插入位點(diǎn)位于3'末端，無法滿足實(shí)驗(yàn)的要求，所以需對該載體進(jìn)行改造，通過2步PCR法在5'端即海腎螢光素酶報(bào)告基因(hRluc)的前面，T7 Promoter之后制造一個(gè)多克隆插入位點(diǎn)。隨后，以人類基因組DNA為模板擴(kuò)增出靶點(diǎn)基因的5'UTR序列

5、，在構(gòu)建好的psiCHECKTM-2雙熒光素酶報(bào)告載體的5'端多克隆位點(diǎn)的上以雙酶切的方式插入，構(gòu)建成野生型的質(zhì)粒載體，再以野生型質(zhì)粒載體為模板通過DpnI定點(diǎn)誘變的方法構(gòu)建突變型載體。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)方面，選擇目前轉(zhuǎn)染效率相對較高的HEK293T細(xì)胞系，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式，分別將野生與突變的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞中。在Dual-Luciferase(@)報(bào)告基因檢測系統(tǒng)上測定熒光值反應(yīng)蛋白表達(dá)的情況，熒光定量PCR測定mR

6、NA水平。
　　結(jié)果：
　　相對于沒有uORF的基因來說，含有uORF的基因?qū)ο掠位虻鞍追g的影響更顯著，而隨著uORF個(gè)數(shù)的增加，對下游蛋白翻譯水平的影響亦出現(xiàn)疊加效應(yīng).根據(jù)這一點(diǎn)，在對ClinVar、TCGA、COSMIC三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫分析后，我們從過濾后TCGA數(shù)據(jù)庫中，在腫瘤病人突變體中挑選了GCSAM、PSTPIP1、HIS1H2BD、CEBPB、VAT1、ERP29六個(gè)靶點(diǎn)基因。其中，野生型的GCSAM、PST

7、PIP1、HIS1H2BD、 VAT1、ERP29這5個(gè)靶點(diǎn)的5'UTR不含有uORF，而野生型的CEBPB的5'UTR則只含有一個(gè)uORF，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　在載體的選擇，采用psiCHECKTM-2雙熒光素酶報(bào)告載體，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，比對載體上的序列與四個(gè)靶點(diǎn)基因的5'UTR序列之后，在hRluc之前，T7Promoter之后成功增加了NdeⅠ、AscⅠ、AgeⅠ、PacⅠ、SalⅠ、SacⅠ六個(gè)酶切位點(diǎn)，通過雙酶切的方

8、式將四個(gè)靶點(diǎn)基因的5'UTR序列插入到該載體的5'端處構(gòu)建野生型質(zhì)粒DNA。DpnⅠ定點(diǎn)誘變之后，GCSAM、 PSTPIP1、HIS1H2BD、ERP29的5'UTR序列均產(chǎn)生了一個(gè)ATG的起始密碼子，并與下游的終止密碼子正好形成3的倍數(shù)，構(gòu)成一個(gè)uORF。VAT1產(chǎn)生了一個(gè)終止密碼子與上游起始密碼子構(gòu)成一個(gè)uORF。與此相反，突變之后，CEBPB的uORF起始密碼子消失，結(jié)果也導(dǎo)致uORF的消失。將構(gòu)建好的野生型與突變型的質(zhì)粒載體分

9、別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，Dual-Luciferase(@)報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的GCSAM、 PSTPIP1、HIS1H2BD由于產(chǎn)生了一個(gè)uORF，其蛋白表達(dá)的水平與突變之前相比下降了大約50％，尤其是PSTPIP1下降的幅度更為顯著，大約為90％。VAT1、ERP29的突變型與野生型無顯著性的差異。而CEBPB突變后蛋白表達(dá)的水平與野生型相比卻升高了近50％。mRNA水平方面的變化，采用熒光定量PCR

10、的方法檢測，四個(gè)靶點(diǎn)基因的突變型與野生型相比，除了PSTPIP1稍微輕度下降之外，其他均無顯著性改變。
　　討論：
　　本項(xiàng)研究的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)表明，uORF廣泛存在與人類基因的轉(zhuǎn)錄本，且是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的一種常見機(jī)制，但是uORF的突變與人類疾病相關(guān)性的報(bào)道卻非常有限，本項(xiàng)研究分析疾病數(shù)據(jù)庫中各種疾病病人大量的變異序列與uORF突變之間的潛在關(guān)系，在分別來自多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌病人基因中挑選

11、四個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GCSAM與人類淋巴瘤疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，它主要在GC B細(xì)胞和來源于GC B細(xì)胞的淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)，由于GCSAM基因表達(dá)的蛋白能夠降低淋巴瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動，所以與疾病的預(yù)后有著莫大關(guān)系。因此，許多的學(xué)者從信號通路、基因小鼠模型，轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用等方面對其表達(dá)調(diào)控的各種機(jī)制做了深入了研究。PSTPIP1作為一種銜接蛋白，主要在造血干細(xì)胞的細(xì)胞骨架中表達(dá)，該基因與一些罕見的常染色體顯性遺傳的自身免疫

12、性疾病相關(guān)，例如化膿性關(guān)節(jié)炎，無菌壞疽性膿皮病，PAPA綜合癥等，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PSTP IP1作為一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子抑制T-cell的激活，該基因的表達(dá)能夠抑制幾種與免疫細(xì)胞功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的活性，它所編碼的蛋白在C末端可以形成一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)越對PSTPIP1的功能十分重要。因此該基因編碼區(qū)堿基的突變是主要的研究熱點(diǎn)。HIST1H2BD是參與編碼真核生物染色質(zhì)(chromatin)上重要的組蛋白的基因之一，目前對于組蛋白家族成

13、員基因的研究還比較少，而此類基因的表達(dá)調(diào)控更是少之又少，到目前為止，對HIST1H2BD表達(dá)的研究僅限于mRNAs3'末端的多聚腺苷酸化。在生理?xiàng)l件下，CEBPB參與粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，角化細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的增殖與分化，C/EBP轉(zhuǎn)錄因子還涉及到機(jī)體多種生理病理的調(diào)控進(jìn)程，例如新陳代謝、炎癥反應(yīng)、疾病的惡性轉(zhuǎn)化等。已有文獻(xiàn)報(bào)道，CEBPB基因上uORF功能失活導(dǎo)致編碼的截短亞類蛋白含量

14、增加，與霍奇金淋巴瘤、間葉性大細(xì)胞淋巴瘤、侵襲性乳腺癌等惡性腫瘤有關(guān)。
　　四個(gè)靶點(diǎn)基因除了CEBPB基因是明確已有文獻(xiàn)報(bào)道對其的uORF介導(dǎo)的翻譯調(diào)控做過深入研究之外，其他3個(gè)靶點(diǎn)基因的表達(dá)與人類疾病的關(guān)系均未牽涉到uORF介導(dǎo)的翻譯調(diào)控，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻證實(shí)這3個(gè)靶點(diǎn)基因的5'UTR突變后所產(chǎn)生的uORF的確對下游基因表達(dá)產(chǎn)生顯著的抑制作用?；谶@一點(diǎn)，有必要對高通量測序數(shù)據(jù)中uORF變化進(jìn)行更為詳實(shí)的注釋，便于發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致或

15、促進(jìn)蛋白表達(dá)變化的新的基因組改變。除了uORF之外，在5'UTR內(nèi)尚存在其他的一些作用元件，這些調(diào)控元件是否與uORF協(xié)同或拮抗的調(diào)控基因表達(dá)，還需要更進(jìn)一步對現(xiàn)有數(shù)據(jù)的挖掘和更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。對于VAT1與ERP29陰性結(jié)果的解釋，可能存在以下幾種原因:①并非所有的uORF都能產(chǎn)生阻遏作用，核糖體可以通過遺漏掃描或重新再起始的機(jī)制，重新引發(fā)翻譯。②可能存在一些其他調(diào)控機(jī)制抵消uORF的阻遏作用。③并非所有含uORF序列特征的基因都存