維生素D受體起始密碼子區(qū)的突變對(duì)下游靶基因CYP3A4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響.pdf

1、第一部分 目的：維生素D受體(VDR)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如CYP3A4，MDR1等。它的表達(dá)和功能的改變可以影響其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致這些基因功能發(fā)生改變。對(duì)它的變異的研究也是探索CYP3A4表達(dá)個(gè)體差異的一個(gè)重點(diǎn)方向。近年來(lái)通過(guò)對(duì)VDR的研究中發(fā)現(xiàn)它存在基因變異，其中起始密碼子區(qū)的Fokl突變被認(rèn)為具有功能意義且與臨床上多種疾病相關(guān)。因此我們從VDR Fokl突變這個(gè)角度進(jìn)行研究，了解

2、此多態(tài)性與結(jié)直腸腫瘤的關(guān)系，以及是否改變了其下游靶基因CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 方法：提取69例結(jié)直腸腫瘤病人及218例健康對(duì)照者外周血基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè)并分析了Fokl突變的分布。同時(shí)構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3-1(-)B-myc/his h VDR(野生型和Fokl突變型)利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)在體外COS-7細(xì)胞中檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同載體后的細(xì)胞

3、在給予不同濃度的藥物1，25(OH)<,2>VD3(VDR的天然配體)處理后， CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。 結(jié)果：在中國(guó)漢族健康志愿者中FokI突變的等位基因頻率是61.4％，與日本人報(bào)道的41.7％和北京地區(qū)報(bào)道的74.3％相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異，P<0.05。對(duì)照組和結(jié)直腸腫瘤病例組起始密碼子區(qū)FokI突變的三種基因型FF，F(xiàn)f, ff分布頻率分別為39.3％，44.2％，16.5％和29％,40％,31％：等位基

4、因F,f分布頻率分別為61.4％，38.6％和49％，51％，等位基因f和ff基因型在結(jié)直腸腫瘤病人中比對(duì)照者的分布頻率高，而等位基因F和FF基因型比對(duì)照者的分布頻率低，其中基因型頻率存在顯著差異(P<0.05)。優(yōu)勢(shì)比分析中，F(xiàn)f基因型人群中結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的OR值為2.00(95％的可信區(qū)間：1.01-3.96)，ff基因型人群中結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的OR值為2.508(95％的可信區(qū)間：1.21-5.18)。在成功構(gòu)建了野生型和突變型

5、的人VDR真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(-)B-myc/his h VDR的基礎(chǔ)上，將野生型和突變型VDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于COS-7細(xì)胞中，在1，25(OH)<,2>VD<,3>孵育24h后，3個(gè)濃度組(1，10，100nmol/L)的代表CYP3A4mRNA轉(zhuǎn)錄水平的熒光素酶活性數(shù)值分別與溶媒對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染Fokl突變型的細(xì)胞熒光素酶活性數(shù)值稍大于轉(zhuǎn)染野生型的細(xì)胞熒光素酶活性數(shù)值，但兩者間

6、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P>0.05)。 結(jié)論：維生素D受體基因起始密碼子區(qū)的Fokl多態(tài)性與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)okl突變是結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的一個(gè)保護(hù)因素?？寺×巳祟?lèi)維生素D受體的基因全長(zhǎng)cDNA序列并成功構(gòu)建了兩種真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(-)B-myc/his hVDR(野生型和Fokl突變型)，我們的研究結(jié)果顯示維生素D受體基因起始密碼子區(qū)的Fokl突變對(duì)下游靶基因CYP3A4mRNA的轉(zhuǎn)錄激活能力與野生型相比沒(méi)有顯著差

7、異。 第二部分 背景：維生素D3是人體必需的一種維生素，研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)<,2>D3有拮抗結(jié)直腸腫瘤的作用，其機(jī)制現(xiàn)已明確， 1，25(OH)<,2>D3在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合一種核受體即維生素D受體(VDR)，激活抑癌基因和抑制前癌基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤的作用，國(guó)外已有一些研究顯示VDRFOKI基因的多態(tài)性與大腸癌發(fā)病相關(guān)。但目前仍缺乏VDR多態(tài)性在中國(guó)結(jié)直腸腫瘤人群中的分布資料，其具

8、有功能意義的VDR FOKI突變是否參與大腸癌的發(fā)病機(jī)制仍屬未知。 目的：分析中國(guó)結(jié)直腸腫瘤人群維生素D受體(VDR)FOKI多態(tài)性的分布特征，探討維生素D受體常見(jiàn)遺傳多態(tài)性在大腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：選擇69例結(jié)直腸腫瘤病人及218例健康對(duì)照者。采用常規(guī)酚氯提取-乙醇沉法獲得外周血基因組DNA；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)并分析了VDR基因起始密碼子區(qū)Fokl突變的分布頻率。

9、 結(jié)果：在中國(guó)漢族健康志愿者中突變等位基因頻率是61.4％，與日本人報(bào)道的41.7％和北京地區(qū)報(bào)道的74.3％相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)照組和結(jié)直腸腫瘤病例組起始密碼子區(qū)的FokI突變?nèi)N基因型FF，F(xiàn)f，ff分布頻率分別為39.3％，44.2％，16.5％和29％，40％，31％：等位基因F，f分布頻率分別為61.4％，38.6％和49％，51％，等位基因f和ff基因型在結(jié)直腸腫瘤病人中比對(duì)照者的分布頻

10、率高，而等位基因F和FF基因型比對(duì)照者的分布頻率低，其中基因型頻率存在顯著差異(P<0.05)。優(yōu)勢(shì)比分析中，F(xiàn)f基因型人群中結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的OR值為2.00(95％的可信區(qū)間：1.01-3.96)，ff基因型人群中結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的OR值為2.508(95％的可信區(qū)間：1.21-5.18)。 結(jié)論：本研究明確了維生素D受體基因起始密碼子區(qū)Fokl的遺傳多態(tài)性在大腸癌人群中的分布特征，同時(shí)揭示了VDR FOKI突變可能降低個(gè)體

11、患大腸腫瘤的危險(xiǎn)性。 第三部分 背景：CYP3A4在人體中的表達(dá)存在顯著的差異，這些差異可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)一些內(nèi)外源性物質(zhì)毒性反應(yīng)的差別從而使得人群對(duì)某些腫瘤的易患性不同。維生素D受體(VDR)作為一種核受體，調(diào)控著下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如CYP3A4；它的表達(dá)和功能的改變可以影響其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致這些基因功能發(fā)生改變。所以對(duì)核受體變異的研究也是探索CYP3A4表達(dá)個(gè)體差異的一個(gè)重點(diǎn)方向。對(duì)VDR的研究發(fā)現(xiàn)起始密

12、碼子區(qū)的Fokl突變被認(rèn)為具有功能意義且與臨床上多種疾病相關(guān)。 目的：確定維生素D受體起始密碼子區(qū)的FokI突變是否改變了下游靶基因CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 方法：從中國(guó)漢族人肝臟組織中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出hVDR cDNA基因的全長(zhǎng)。將純化的VDR的RT-PCR產(chǎn)物用EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切與pcDNA3.1(-)B-myc/his載體連接形成重組載體pcDNA3.1(-)B-myc/hish

13、VDR(野生型和FokI突變型)：對(duì)野生型的hVDR質(zhì)粒進(jìn)行誘變，構(gòu)建突變的FokI hVDR質(zhì)粒。利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，給予不同濃度的藥物孵育，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)在體外COS-7細(xì)胞中檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同載體后的細(xì)胞CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。 結(jié)果：從肝組織RNA中分別擴(kuò)增得到1300bp的目的基因片斷。重組質(zhì)粒被限制性?xún)?nèi)切酶切為兩條帶：一條為1300bp(hVDR)，一條為5500bp(空載體pcDNA3.1(-)B-my

14、c/his)；片斷的大小與理論值相符。RT-PCR擴(kuò)增的hVDR經(jīng)測(cè)序，其結(jié)果與Genbank上hVDR序列完全相同；并構(gòu)建了VDR FOKI突變的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染野生型和突變型VDR質(zhì)粒于COS-7細(xì)胞中，在1，25(OH)2VD3孵育24h后，3個(gè)濃度組(1，10，100nmol/L)的代表CYP3A4mRNA轉(zhuǎn)錄水平的熒光素酶活性數(shù)值分別與溶媒對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染Fokl突變型的細(xì)胞熒光素酶活性