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1、目的:在成骨分化過(guò)程中,若祖細(xì)胞在向終末成骨分化為成骨細(xì)胞過(guò)程中的信號(hào)通路中斷,可導(dǎo)致骨肉瘤的生成。誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞向成骨方向分化,可能會(huì)抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型,因此,我們應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建具有成骨分化作用的人LMP-1基因腺病毒重組體,感染體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞系U2OS,并鑒定LMP-1基因在U2OS中的表達(dá),為研究骨肉瘤細(xì)胞成骨分化奠定基礎(chǔ)。
方法:以K562細(xì)胞的cDNA為文庫(kù),采用PCR方法對(duì)LM
2、P-1進(jìn)行擴(kuò)增,將目的基因通過(guò)TA克隆與pGEM-T載體連接并測(cè)序。雙酶切后將目的基因插入至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV,經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定,轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞系并通過(guò)熒光顯微鏡、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)pAdtrack-CMV-LMP-1的表達(dá)。線(xiàn)性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌內(nèi)完成與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒AdLMP-1。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)在
3、HEK-293A細(xì)胞內(nèi)包裝出重組腺病毒AdLMP-1,大量擴(kuò)增、純化并測(cè)定滴度。用AdLMP-1感染骨肉瘤細(xì)胞系U2OS,通過(guò)熒光顯微鏡、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)LMP-1在U2OS細(xì)胞中的表達(dá)。
結(jié)果:限制性雙酶切和DNA測(cè)序鑒定穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-LMP-1構(gòu)建成功,熒光顯微鏡證實(shí)轉(zhuǎn)染了pAdtrack-CMV-LMP-1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá);RT-qPCR
4、發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照、空載轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染后24h,HEK-293T細(xì)胞LMP-1 mRNA表達(dá)量升高800倍,轉(zhuǎn)染后48h后升高1500倍,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*p<0.01);Western blot驗(yàn)證了LMP-1及His標(biāo)簽蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。AdLMP-1通過(guò)擴(kuò)增、純化滴度達(dá)到1.5x109pfu/ml。熒光顯微鏡下觀(guān)察AdLMP-1感染的U2OS內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá);RT-qPCR發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照、轉(zhuǎn)染空載AdGFP組
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