HA表位標(biāo)記的azurin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2OS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預(yù)后差。目前臨床上對(duì)骨肉瘤的治療多采用手術(shù)、化療等綜合治療，使得患者的五年生存率較以前顯著提高。大劑量化療帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療難以完全治愈。最近，使用活致病菌、減毒致病菌或致病菌的純化產(chǎn)物用于腫瘤治療是研究熱點(diǎn)之一。 微生物病原體感染能引起人類和動(dòng)物體內(nèi)惡性腫瘤的退變，但活菌因其產(chǎn)生明顯的毒性和副作用限制了其在人類

2、腫瘤治療中的應(yīng)用。因此，目前傾向于尋找具有抗腫瘤作用的致病菌的純代謝產(chǎn)物用于癌癥治療。azurin就是近年發(fā)現(xiàn)的一種很有前途的抗腫瘤生物蛋白之一。 azurin最初是從銅綠假單胞菌分泌的一種參與細(xì)胞氧化還原反應(yīng)中的電子傳遞作用的蘭銅蛋白，近期的研究證實(shí)azurin在體外和荷瘤裸鼠體內(nèi)可選擇性的誘導(dǎo)某些黑色素瘤和人乳腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)azurin在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，對(duì)機(jī)體無毒副作用。我們課題組已構(gòu)建了包含azuri

3、n全長(zhǎng)DNA的pqe30/azurin載體，獲得了能表達(dá)azurin的工程活菌M15，純化出有活性的azurin，前期研究還發(fā)現(xiàn)azurin在體外能選擇性的誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡，但目前采用工程活菌M15并不能獲得大量的、有活性的、純化azurin用于臨床的長(zhǎng)期治療。因此本研究首次將azurin基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，并將該真核表達(dá)載體導(dǎo)入人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，使azurin蛋白在人骨肉瘤U2OS細(xì)胞中得到有

4、效表達(dá)，進(jìn)一步研究azurin在骨肉瘤基因治療中的作用。 研究目的1.應(yīng)用定向克隆z技術(shù)構(gòu)建帶有流感病毒血凝素9肽表位標(biāo)簽(HAtag)標(biāo)記的azurincDNA基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/azurin，酶切鑒定和測(cè)序。2.采用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/azurin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞。檢測(cè)pcDNA3.1(+)/azurin基因轉(zhuǎn)染是否具有促進(jìn)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋

5、亡的生物學(xué)活性；檢測(cè)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞所分泌的azurin在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡時(shí)bcl-2、bax、bcl-xl、p53和Survivin等凋亡相關(guān)基因的變化，探討azurin誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 研究方法本課題的實(shí)驗(yàn)分兩部分。 第一部分的實(shí)驗(yàn)，通過PCR擴(kuò)增獲得流感病毒血凝素9肽表位標(biāo)簽(HAtag)標(biāo)記的的azurincDNA片斷，應(yīng)用定向克隆技術(shù)將該DNA片斷裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)

6、建帶有血凝素抗原標(biāo)記肽(HA)的azurincDNA基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/azurin，酶切鑒定和測(cè)序。 第二部分的實(shí)驗(yàn)，采用LipofectAMINE2000基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將該真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞；RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞azurinmRNA、Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞表達(dá)azurin蛋白；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒的人骨

7、肉瘤U2OS細(xì)胞所分泌的azurin對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞典型梯狀電泳帶；半定量RT-PCR檢測(cè)azurin在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡時(shí)bcl-2、bax、bcl-xl、p53和Survivin等凋亡相關(guān)基因的變化。 研究結(jié)果1.經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/azurin堿基序列和閱讀框架正確。 2.采用LipofectAMINE2000基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將

8、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/azurin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2OS細(xì)胞72小時(shí)后。 1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RT-PCR分析結(jié)果顯示：pcDNA3.1(+)/azurin轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2OS細(xì)胞后獲得了約414bp的目的條帶。 2)Westemblot檢測(cè)結(jié)果顯示：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/azurin的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞中有azurin-HA的表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞能表達(dá)azurin。 3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯

9、示：與空白組和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染有azurin基因的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，其G0/G1期細(xì)胞減少明顯，S期和G2/M期細(xì)胞也減少；轉(zhuǎn)染組的凋亡率為64.30％±13.12％，明顯高于空白組的10.16％±1.87％和對(duì)照組的16.42％±7.19％，差異有意義，說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的azurin能有效促進(jìn)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡。 4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/azurin的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞典型梯狀電泳帶

10、，而在空白組、對(duì)照組均呈現(xiàn)單一電泳帶。 5)半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的azurin在有效促進(jìn)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡時(shí)，促凋亡相關(guān)基因baxmRNA水平明顯高于對(duì)照組和空白組，bax/β-actin光密度比值在轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組和空白組分別為0.45、0.22和0.13；促凋亡相關(guān)基因p53mRNA水平也明顯高于對(duì)照組和空白組，p53/β-actin光密度比值在轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組和空白組分別為0.3、0.2和0.12

11、；抑凋亡相關(guān)基因bcl-2mRNA水平明顯低于對(duì)照組和空白組，bcl-2/β-actin光密度比值在轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組和空白組分別為0.26、0.41和1.02；凋亡相關(guān)基因bcl-xlmRNA、SurvivinmRNA水平在各組基本一致。 結(jié)論1.實(shí)驗(yàn)得到的含azurin基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/azurin經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)：堿基序列和閱讀框架正確。 2.本實(shí)驗(yàn)成功地將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)