人Tumstatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其體內(nèi)表達(dá)抑制裸鼠U251移植瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文人Tumstatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其體內(nèi)表達(dá)抑制裸鼠U251移植瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究姓名：葉紅星申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)外科指導(dǎo)教師：袁賢瑞20090501中南大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要第一部分人Tumstatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建目的構(gòu)建抗血管生成的入腫瘤抑素(Tumstatin)基因真核表達(dá)載體，為后續(xù)體外Tumstatin轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞及其在荷瘤裸鼠(BALB／N)的體內(nèi)表達(dá)創(chuàng)造條件。方法1、從H

2、EK293細(xì)胞提取總RNA，通過RTPCR擴(kuò)增出Tumstatin基因。2、將該基因?qū)肟寺≥d體pUC57T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Q進(jìn)行擴(kuò)增，并提取純化，對(duì)所獲重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列分析鑒定。3、用內(nèi)切酶NheI和NotI對(duì)重組質(zhì)粒pUC57Tumstatin雙酶切，并純化目的基因片段，同時(shí)用內(nèi)切酶NheI和NotI對(duì)質(zhì)粒pcDNA31()進(jìn)行雙酶切。取純化的目的基因片段與表達(dá)載體pcDNA31()在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接

3、反應(yīng)。經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)后，制備和純化重組質(zhì)粒。結(jié)果l、提取的RNA經(jīng)電泳有明顯的28S、18S、5S三條帶，分光光度法測(cè)得A260／A280=18933，提示RNA無明顯降解；RTPCR產(chǎn)物電泳顯示在750bp處有一特異性條帶。2、重組質(zhì)粒pUC57TumstatinDNA測(cè)序結(jié)果顯示插入的目的基因與GenBank收錄的人Tumstatin基因eDNA序列完全一致，無任何突變。3、重組質(zhì)粒pcDNA31Tumsta