ASODN轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞對Survivin與VEGF表達的影響.pdf

1、目的：利用反義技術(shù)分別封閉Survivin基因和VEGF因子在骨肉瘤細胞中的表達，分析兩者在骨腫瘤細胞增殖和血管生成中的作用并探討兩者的相互關(guān)系，為研究骨腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。同時，靶向調(diào)節(jié)Survivin基因和VEGF因子可能為骨肉瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)骨肉瘤細胞(9607細胞系)，分為實驗組和對照組。分別采用脂質(zhì)體介導(dǎo)Survivin基因反義寡核苷酸(Survivin antisenseoligon

2、ucleotide，Survivin-ASODN)和VEGF因子反義寡核苷酸(VEGF-ASODN)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞，以空脂質(zhì)體處理對照組細胞。采用MTT法檢測各組細胞的增殖抑制率，RT-PCR法檢測各組細胞中Survivin和VEGF mRNA的表達，免疫組織化學(xué)S-P法檢測各組細胞Survivin和VEGF的蛋白表達。 結(jié)果：(1)經(jīng)同濃度Survivin-ASODN和VEGF-ASODN處理的9607細胞，在所測定時間點內(nèi)(

3、24、48、72小時)所測得各組細胞抑制率Survivin-ASODN組分別為(31.400±0.691)％、(52.515±0.870)％、(78.473±1.025)％。VEGF-ASODN組分別為(28.511±0.825)％、(49.292±0.900)％、 (71.349±1.223)％兩者均較對照組明顯升高(P＜0.05)。(2)RT-PCR檢測各組細胞mRNA表達，經(jīng)過Quantity One圖像分析。在Survivin-

4、ASODN組和VEGF-ASODN組Survivin mRNA相對表達量分別為(1.5198±0.084)和(1.6261±0.091)，均低于對照組(1.9610±0.094)，有顯著性差異(P＜0.05)；VEGF mRNA的相對表達量分別為(1.7489±0.065)和(1.5429±0.064)較對照組(2.0453±0.082)降低，有顯著性差異(P＜0.05)。在Survivin-ASODN組中Survivin mRNA和V

5、EGF mRNA表達量均降低，而且在VEGF-ASODN組中VEGFmRNA和Survivin mRNA表達量也都降低。經(jīng)相關(guān)分析Survivin-ASODN組Survivin mRNA與VEGF mRNA表達量抑制率的相關(guān)系數(shù)r=0.602(p=0.038)；VEGF-ASODN組中VEGF mRNA與Survivin mRNA表達量的抑制率相關(guān)系數(shù)r=0.702，(p=0.011)兩者呈正相關(guān)。(3)鏡下觀察，空脂質(zhì)體組細胞形態(tài)基本

6、正常，貼壁性良好，生長旺盛；免疫細胞化學(xué)鏡下，棕色陽性顆粒主要見于細胞胞漿內(nèi)，彌漫分布，胞核內(nèi)少見陽性染色；ASODN組細胞體積漸小，形態(tài)不整或鼓泡，一些細胞變圓、皺縮，脫壁懸浮細胞增多，細胞生長緩慢；免疫細胞化學(xué)鏡下，胞漿內(nèi)陽性染色消失或變?nèi)酢?4)經(jīng)免疫組化評分細胞蛋白表達強弱分析，表明ASODN組細胞中Survivin蛋白和VEGF蛋白的表達量均較對照組的蛋白表達量下降，有顯著性差異，(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)Sur

7、vivin基因和VEGF因子在骨肉瘤細胞中均有表達。 (2)反義技術(shù)能夠特異地封閉靶基因，有效抑制腫瘤細胞的生長，且封閉效果有明顯的時間依賴性，Survivin-ASODN和VEGF-ASODN轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞后，瘤細胞均出現(xiàn)抑制。 (3)Survivin基因下調(diào)的同時出現(xiàn)了VEGF因子的下調(diào)。并且在VEGF因子下調(diào)的同時出現(xiàn)Survivin基因下調(diào)。提示Survivin基因和VEGF因子兩者在細胞內(nèi)部相互存在某種調(diào)節(jié)機制