ASODN轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Survivin與VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：利用反義技術(shù)分別封閉Survivin基因和VEGF因子在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，分析兩者在骨腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成中的作用并探討兩者的相互關(guān)系，為研究骨腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。同時(shí)，靶向調(diào)節(jié)Survivin基因和VEGF因子可能為骨肉瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞(9607細(xì)胞系)，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。分別采用脂質(zhì)體介導(dǎo)Survivin基因反義寡核苷酸(Survivin antisenseoligon

2、ucleotide，Survivin-ASODN)和VEGF因子反義寡核苷酸(VEGF-ASODN)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞，以空脂質(zhì)體處理對(duì)照組細(xì)胞。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin和VEGF mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)各組細(xì)胞Survivin和VEGF的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：(1)經(jīng)同濃度Survivin-ASODN和VEGF-ASODN處理的9607細(xì)胞，在所測(cè)定時(shí)間點(diǎn)內(nèi)(

3、24、48、72小時(shí))所測(cè)得各組細(xì)胞抑制率Survivin-ASODN組分別為(31.400±0.691)％、(52.515±0.870)％、(78.473±1.025)％。VEGF-ASODN組分別為(28.511±0.825)％、(49.292±0.900)％、 (71.349±1.223)％兩者均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。(2)RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞mRNA表達(dá)，經(jīng)過(guò)Quantity One圖像分析。在Survivin-

4、ASODN組和VEGF-ASODN組Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.5198±0.084)和(1.6261±0.091)，均低于對(duì)照組(1.9610±0.094)，有顯著性差異(P＜0.05)；VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.7489±0.065)和(1.5429±0.064)較對(duì)照組(2.0453±0.082)降低，有顯著性差異(P＜0.05)。在Survivin-ASODN組中Survivin mRNA和V

5、EGF mRNA表達(dá)量均降低，而且在VEGF-ASODN組中VEGFmRNA和Survivin mRNA表達(dá)量也都降低。經(jīng)相關(guān)分析Survivin-ASODN組Survivin mRNA與VEGF mRNA表達(dá)量抑制率的相關(guān)系數(shù)r=0.602(p=0.038)；VEGF-ASODN組中VEGF mRNA與Survivin mRNA表達(dá)量的抑制率相關(guān)系數(shù)r=0.702，(p=0.011)兩者呈正相關(guān)。(3)鏡下觀察，空脂質(zhì)體組細(xì)胞形態(tài)基本

6、正常，貼壁性良好，生長(zhǎng)旺盛；免疫細(xì)胞化學(xué)鏡下，棕色陽(yáng)性顆粒主要見(jiàn)于細(xì)胞胞漿內(nèi)，彌漫分布，胞核內(nèi)少見(jiàn)陽(yáng)性染色；ASODN組細(xì)胞體積漸小，形態(tài)不整或鼓泡，一些細(xì)胞變圓、皺縮，脫壁懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；免疫細(xì)胞化學(xué)鏡下，胞漿內(nèi)陽(yáng)性染色消失或變?nèi)酢?4)經(jīng)免疫組化評(píng)分細(xì)胞蛋白表達(dá)強(qiáng)弱分析，表明ASODN組細(xì)胞中Survivin蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)量均較對(duì)照組的蛋白表達(dá)量下降，有顯著性差異，(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)Sur

7、vivin基因和VEGF因子在骨肉瘤細(xì)胞中均有表達(dá)。 (2)反義技術(shù)能夠特異地封閉靶基因，有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且封閉效果有明顯的時(shí)間依賴性，Survivin-ASODN和VEGF-ASODN轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞后，瘤細(xì)胞均出現(xiàn)抑制。 (3)Survivin基因下調(diào)的同時(shí)出現(xiàn)了VEGF因子的下調(diào)。并且在VEGF因子下調(diào)的同時(shí)出現(xiàn)Survivin基因下調(diào)。提示Survivin基因和VEGF因子兩者在細(xì)胞內(nèi)部相互存在某種調(diào)節(jié)機(jī)制