腺病毒介導(dǎo)hBMP-2轉(zhuǎn)染ADSCs治療兔骨質(zhì)疏松性骨折的實驗研究.pdf

1、目的：利用腺病毒載體將hBMP-2基因轉(zhuǎn)染于ADSCs，并將其局部注入骨質(zhì)疏松性骨折模型兔的骨折處，觀察其對骨折修復(fù)的影響。
　　方法：(1)將所獲得的新西蘭兔頸背部脂肪組織用無酶法分離、提取ADSCs，行傳代培養(yǎng)后取P3細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)測定CD44、CD49d、CD34、CD106特異性表面抗原。P3細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用茜紅素染色對其成骨分化能力做進(jìn)一步鑒定。
　　(2)通過HEK293細(xì)胞擴(kuò)增Ad-hBMP-2/

2、GFP。經(jīng)反復(fù)感染、凍融后，收集并純化病毒液，以MOI100將其接種于ADSCs，培養(yǎng)至6d時置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至第10d的ADSCs行RT-PCR檢測hBMP-2 mRNA表達(dá)，并用免疫熒光法檢測不同時間段hBMP-2蛋白的表達(dá)情況。
　　(3)取骨質(zhì)疏松模型兔60只，隨機分為轉(zhuǎn)染組（20只）、未轉(zhuǎn)染組（20只）、空白對照組（20只）并人為切斷股骨干（深度達(dá)橫截面1/3），每組兔于骨折術(shù)后24h內(nèi)分別行以

3、下處理：局部注射轉(zhuǎn)染ADSCs；局部注射未經(jīng)轉(zhuǎn)染的ADSCs；局部注射生理鹽水。分別取注射后第2、4、7周的三組模型兔，X線攝片后用半定量評分法對骨折恢復(fù)情況進(jìn)行評分并對骨折處行骨密度檢查，所得數(shù)據(jù)由SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析：3組數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，單因素方差分析評價總體差異后，再利用SNK檢驗對不同組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較。
　　結(jié)果：(1)將獲得的ADSCs置于相差顯微鏡下觀察顯示：經(jīng)培養(yǎng)72h后，可見有呈成纖維細(xì)胞樣細(xì)

4、胞析出并快速增殖，在第6日時鋪滿瓶底。析出的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)特征。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢驗P3細(xì)胞表面特異性抗原，結(jié)果表明80％以上細(xì)胞表面抗原CD44、CD49d呈陽性反應(yīng)，CD34、CD106為陰性。茜紅素染色檢測結(jié)果：P3細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至21d時，顯微鏡下觀察有若干紅染鈣結(jié)節(jié)形成，證實獲得了較高純度的ADSCs。
　　(2)構(gòu)建完成的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染HEK293細(xì)胞，3d后HEK293

5、細(xì)胞可出現(xiàn)完全 CEP現(xiàn)象。檢測腺病毒滴度可達(dá)5×108 PFU/ml。將純化后的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染ADSCs并檢測轉(zhuǎn)染效率，6d時GFP表達(dá)量達(dá)高峰，此時轉(zhuǎn)染率約85%。RT-PCR檢測hBMP-2 mRNA表達(dá)：轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)440bp的hBMP-2 cDNA片段，未轉(zhuǎn)染組未見hBMP-2 cDNA特異性條帶顯影。免疫組織學(xué)檢查，hBMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs后7d，ADSCs胞質(zhì)中可見明顯hBMP-2蛋白表達(dá)

6、。
　　(3)各時段3組動物X線評分及骨密度數(shù)據(jù)方差具有齊次性(P>0.05)，單因素方差分析有顯著性差異(P<0.05)。不同時段各組兔X線評分SNK檢驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組骨折愈合 X射線評分較空白對照組高(P<0.05)。轉(zhuǎn)染組骨折愈合 X射線評分高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。骨折處骨密度數(shù)據(jù)SNK檢驗結(jié)果提示：局部注射2周后3組骨痂密度均有所增高，但空白對照組明顯低于轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組（P<0.05），骨密度檢測值轉(zhuǎn)染

7、組較未轉(zhuǎn)染組高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；第4周時，3組骨痂處骨密度均進(jìn)一步增高，趨勢延續(xù)第2周（P<0.05）；第7周，轉(zhuǎn)染組骨痂骨密度較另外兩組明顯降低（P<0.05），空白對照組高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　(1)利用無酶法可獲得較高純度ADSCs。
　　(2) Ad-hBMP-2成功轉(zhuǎn)染的ADSCs可明顯表達(dá)hBMP-2蛋白。
　　(3) hBMP-2轉(zhuǎn)染后的ADSCs局部注射