L-arginine促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合的實驗研究.pdf

1、目的 觀察骨質(zhì)疏松性骨折愈合的病理特點，研究L-arginine對骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響，并探討其作用機制。 方法 1．采用酶消化法分離培養(yǎng)得到大鼠成骨細胞，經(jīng)鑒定證實為成骨細胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L一arginine和PTH后，應(yīng)用MTT法測定成骨細胞增殖率的變化，蛋白印跡分析成骨細胞OPG蛋白的表達情況，免疫組化法分析對成骨細胞中eNOS及iNOS的影響。 2．采用骨髓誘導(dǎo)法分離培養(yǎng)得到大

2、鼠破骨細胞，經(jīng)鑒定證實為破骨細胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L-arginine后，相差顯微鏡觀察連續(xù)觀察破骨細胞數(shù)目和形態(tài)的變化，將TRAP染色后的細胞進行TRAP陽性細胞觀察與計數(shù)，并對骨磨片上的骨吸收陷窩進行定量分析。 3．應(yīng)用去卵巢低鈣飲食大鼠于術(shù)后3個月證實發(fā)生骨質(zhì)疏松后，于左側(cè)股骨中段制作骨質(zhì)疏松性骨折模型，分別于術(shù)后1周，2周，4周，8周和12周，X線觀察骨折愈合大體情況，雙能X線骨密度儀檢測左側(cè)股骨BMD的變化

3、，組織學(xué)檢測骨質(zhì)疏松性骨折愈合情況，應(yīng)用免疫組化法測定骨折愈合過程中eNOS及iNOS的表達，檢測血清生化指標的變化，并均與正常骨折愈合過程進行對照。 4．對骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠分別給予12周的不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<,l-34>，密鈣息，福善美，同時給予骨質(zhì)疏松模型組大鼠和假手術(shù)組大鼠等體積的生理鹽水，分別于治療后1周，2周，4周，8周和12周進行x線，BMD，組織學(xué)和血清生化指標檢測。

4、 結(jié)果 1．培養(yǎng)得到的大鼠成骨細胞具有典型形態(tài)結(jié)構(gòu)，堿性磷酸酶染色陽性細胞數(shù)超過90％，可形成鈣結(jié)節(jié)。MTT試驗各組隨培養(yǎng)時間的延長成骨細胞OD值均增加，當(dāng)培養(yǎng)液中含PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時，均較其余實驗組明顯增加成骨細胞OD值。Western雜交分析表明，成骨細胞可以分泌OPG蛋白，試驗濃度的L-arginine和PTH均促進了OPG蛋白的表達，尤以PTH濃度為10<'-6>m

5、ol／L或L-arginine濃度為0.6 g／L最為顯著。免疫組化分析成骨細胞中eNOS及iNOS的表達發(fā)現(xiàn)，同一濃度的L-arginine促進成骨細胞表達iNOS的陽性細胞數(shù)較eNOS的陽性細胞更多；當(dāng)L-arginine濃度為0.6g／L時，成骨細胞表達iNOS及eNOS的陽性細胞數(shù)最多。 2．經(jīng)骨髓誘導(dǎo)方法得到的破骨細胞具有典型的破骨細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，特異性酶染色-TRAP染色證實所培養(yǎng)的細胞是破骨細胞，且能在骨片上形成典型

6、的骨吸收陷窩，具有骨吸收功能。當(dāng)培養(yǎng)液中加入不同實驗濃度的L-arginine后，隨L-arginine濃度的升高TRAP陽性細胞逐漸減少，骨吸收陷窩數(shù)目均顯著減少，并且骨吸收陷窩面積和數(shù)目均隨培養(yǎng)液中L-arginine濃度的升高而下降。 3．對去卵巢大鼠飼以低鈣飼料，3個月后證實發(fā)生骨質(zhì)疏松后，再行左側(cè)股骨中段骨折制作骨質(zhì)疏松性骨折動物模型。于術(shù)后1周，2周，4周，8周和12周，檢測左側(cè)股骨BMD值，隨時間延長其左側(cè)股骨BM

7、D值呈升高趨勢，OPF組大鼠左側(cè)股骨BMD在實驗的各個時期均較SOF組均顯著降低。經(jīng)x線觀察和組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，OPF組大鼠骨痂生成相對較少，軟骨化成骨過程滯后；新生骨小梁粗細不均且排列紊亂，與主應(yīng)力方向不一致，連續(xù)性較差；骨小梁周邊成骨細胞和骨細胞較SO組少，但破骨細胞數(shù)量增多，骨吸收活動活躍，骨轉(zhuǎn)換率較快。骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段可見iNOS和eNOS表達陽性的細胞。iNOS在成纖維細胞、成軟骨細胞和血管內(nèi)膜表達，eNOS主要在骨折

8、處增生的血管內(nèi)膜表達；iNOS和eNOS分別于骨折后1周和2周處在其表達高峰。血清生化指標檢測表明，兩組實驗動物血清ALP在各時間段差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。OPF組大鼠骨折術(shù)后1周時直到實驗結(jié)束，血清BAP和CTX水平始終維持在高水平，且與SOF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后12周時，OPF組大鼠血清NO水平和雌激素水平均較SOF組大鼠顯著下降。 4．對骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠分別給予不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<

9、,1-34>，密鈣息，福善美，于藥物治療后l周，2周，4周，8周和12周，檢測左側(cè)股骨BMD值，各組實驗動物左側(cè)股骨BMD值呈增高趨勢，與骨質(zhì)疏松性骨折模型組大鼠相比前4周各時間段左側(cè)股骨BMD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，至治療后8周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。X線觀察和組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，L-arginine，易維特，密鈣息，福善美等骨吸收抑制劑，可以促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期的間充質(zhì)細胞、成纖維細胞；粒細胞、單核．巨噬細胞等細胞聚集，毛細血管增生，纖

10、維骨痂形成增多；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序。骨折愈合晚期減少破骨細胞數(shù)量，抑制破骨細胞骨吸收；至藥物治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，骨重建較好。PTH可以在骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期促進血腫機化，纖維骨痂形成增多；增強成骨細胞數(shù)量和成骨細胞功能活性，骨量增加明顯，新生骨小梁排列較緊密，有序，骨小梁表面破骨細胞數(shù)量多，破骨細胞吸收明顯；至治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，外骨痂較多，骨重建現(xiàn)象活躍。骨質(zhì)疏松

11、性骨折大鼠經(jīng)L-arginine，易維特，密鈣息和福善美藥物治療后，血清BAP和CTX水平呈下降趨勢，且在4周后與骨質(zhì)疏松性骨折模型組相比明顯下降，而福善美組實驗動物血清CTX水平于治療后2周即較對照組明顯下降；rhPTH<,1-34>組大鼠血清BAP水平呈升高趨勢，4周后明顯高于對照組組血清BAP水平，血清CTX水平無明顯變化，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；各組實驗動物于藥物治療后12周時，血清NO水平均較對照組大鼠顯著升高。 結(jié)

12、論 1．實驗證明PTH和L-argnine均明顯促進成骨細胞分裂增殖，提高成骨細胞功能活性。而當(dāng)PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時，是利于成骨細胞分裂生長的最佳濃度，且促進成骨細胞OPG的表達量最大。當(dāng)L-arginine濃度為0.6g／L時，成骨細胞表達iNOS及eNOS的陽性細胞數(shù)最多，由此進一步說明L-arginine濃度為0.6g／L是促進成骨細胞功能的最佳濃度。 2．采用骨

13、髓誘導(dǎo)方法培養(yǎng)得到的破骨細胞數(shù)量較多，純度較高，且具有明顯的骨吸收功能。不同濃度的L-arginine加入破骨細胞體外培養(yǎng)體系后，經(jīng)TRAP陽性細胞觀察計數(shù)和骨吸收陷窩定量分析后，發(fā)現(xiàn)0.3g／L的L-atginine即明顯抑制破骨細胞的形成，并降低破骨細胞骨吸收功能，隨著L-arginine濃度的升高，這種抑制破骨細胞的作用更加明顯。 3．通過成功建立骨質(zhì)疏松性股骨中段骨折發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松后明顯影響骨折愈合，骨折后早

14、期骨折斷端的成骨細胞形成減少，血腫機化延遲；骨折愈合的中晚期軟骨性骨痂生成量增多，但向骨性骨痂演變過程延緩，破骨細胞骨吸收活躍，骨礦物沉積減少，骨痂質(zhì)量下降，骨質(zhì)疏松性骨折愈合明顯延遲，對臨床具有明顯重要的指導(dǎo)意義。 NOS在骨質(zhì)疏松性骨折愈合的不同時期表達具有類型特異性和時間依賴性。iNOS和eNOS在骨質(zhì)疏松性骨折愈合的不同時期，它們表達的強弱也有所不同。 血清BAP和CTX的變化可以早期反映骨質(zhì)疏松性骨折骨代謝變化

15、的特點，具有簡便易行，靈敏度高等特點。通過測量血清BAP和CTX的水平，可以判斷骨質(zhì)疏松性骨折時骨重建情況，監(jiān)測骨質(zhì)疏松性骨折的治療。 4．實驗研究首次證明L-arginine促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期的炎癥細胞聚集，毛細血管增生，血腫機化；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序，增加骨量。骨折愈合晚期減少破骨細胞數(shù)量，抑制破骨細胞骨吸收，使骨重建平衡，加速骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，提高骨折愈合質(zhì)量。L-arginine促進骨