L-arginine促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 觀察骨質(zhì)疏松性骨折愈合的病理特點(diǎn)，研究L-arginine對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法 1．采用酶消化法分離培養(yǎng)得到大鼠成骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定證實(shí)為成骨細(xì)胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L一arginine和PTH后，應(yīng)用MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞增殖率的變化，蛋白印跡分析成骨細(xì)胞OPG蛋白的表達(dá)情況，免疫組化法分析對(duì)成骨細(xì)胞中eNOS及iNOS的影響。 2．采用骨髓誘導(dǎo)法分離培養(yǎng)得到大

2、鼠破骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定證實(shí)為破骨細(xì)胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L-arginine后，相差顯微鏡觀察連續(xù)觀察破骨細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的變化，將TRAP染色后的細(xì)胞進(jìn)行TRAP陽(yáng)性細(xì)胞觀察與計(jì)數(shù)，并對(duì)骨磨片上的骨吸收陷窩進(jìn)行定量分析。 3．應(yīng)用去卵巢低鈣飲食大鼠于術(shù)后3個(gè)月證實(shí)發(fā)生骨質(zhì)疏松后，于左側(cè)股骨中段制作骨質(zhì)疏松性骨折模型，分別于術(shù)后1周，2周，4周，8周和12周，X線觀察骨折愈合大體情況，雙能X線骨密度儀檢測(cè)左側(cè)股骨BMD的變化

3、，組織學(xué)檢測(cè)骨質(zhì)疏松性骨折愈合情況，應(yīng)用免疫組化法測(cè)定骨折愈合過(guò)程中eNOS及iNOS的表達(dá)，檢測(cè)血清生化指標(biāo)的變化，并均與正常骨折愈合過(guò)程進(jìn)行對(duì)照。 4．對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠分別給予12周的不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<,l-34>，密鈣息，福善美，同時(shí)給予骨質(zhì)疏松模型組大鼠和假手術(shù)組大鼠等體積的生理鹽水，分別于治療后1周，2周，4周，8周和12周進(jìn)行x線，BMD，組織學(xué)和血清生化指標(biāo)檢測(cè)。

4、 結(jié)果 1．培養(yǎng)得到的大鼠成骨細(xì)胞具有典型形態(tài)結(jié)構(gòu)，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)90％，可形成鈣結(jié)節(jié)。MTT試驗(yàn)各組隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)成骨細(xì)胞OD值均增加，當(dāng)培養(yǎng)液中含PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時(shí)，均較其余實(shí)驗(yàn)組明顯增加成骨細(xì)胞OD值。Western雜交分析表明，成骨細(xì)胞可以分泌OPG蛋白，試驗(yàn)濃度的L-arginine和PTH均促進(jìn)了OPG蛋白的表達(dá)，尤以PTH濃度為10<'-6>m

5、ol／L或L-arginine濃度為0.6 g／L最為顯著。免疫組化分析成骨細(xì)胞中eNOS及iNOS的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，同一濃度的L-arginine促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)iNOS的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較eNOS的陽(yáng)性細(xì)胞更多；當(dāng)L-arginine濃度為0.6g／L時(shí)，成骨細(xì)胞表達(dá)iNOS及eNOS的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多。 2．經(jīng)骨髓誘導(dǎo)方法得到的破骨細(xì)胞具有典型的破骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，特異性酶染色-TRAP染色證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞是破骨細(xì)胞，且能在骨片上形成典型

6、的骨吸收陷窩，具有骨吸收功能。當(dāng)培養(yǎng)液中加入不同實(shí)驗(yàn)濃度的L-arginine后，隨L-arginine濃度的升高TRAP陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，骨吸收陷窩數(shù)目均顯著減少，并且骨吸收陷窩面積和數(shù)目均隨培養(yǎng)液中L-arginine濃度的升高而下降。 3．對(duì)去卵巢大鼠飼以低鈣飼料，3個(gè)月后證實(shí)發(fā)生骨質(zhì)疏松后，再行左側(cè)股骨中段骨折制作骨質(zhì)疏松性骨折動(dòng)物模型。于術(shù)后1周，2周，4周，8周和12周，檢測(cè)左側(cè)股骨BMD值，隨時(shí)間延長(zhǎng)其左側(cè)股骨BM

7、D值呈升高趨勢(shì)，OPF組大鼠左側(cè)股骨BMD在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)時(shí)期均較SOF組均顯著降低。經(jīng)x線觀察和組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OPF組大鼠骨痂生成相對(duì)較少，軟骨化成骨過(guò)程滯后；新生骨小梁粗細(xì)不均且排列紊亂，與主應(yīng)力方向不一致，連續(xù)性較差；骨小梁周邊成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞較SO組少，但破骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨吸收活動(dòng)活躍，骨轉(zhuǎn)換率較快。骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段可見(jiàn)iNOS和eNOS表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。iNOS在成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和血管內(nèi)膜表達(dá)，eNOS主要在骨折

8、處增生的血管內(nèi)膜表達(dá)；iNOS和eNOS分別于骨折后1周和2周處在其表達(dá)高峰。血清生化指標(biāo)檢測(cè)表明，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清ALP在各時(shí)間段差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OPF組大鼠骨折術(shù)后1周時(shí)直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，血清BAP和CTX水平始終維持在高水平，且與SOF組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后12周時(shí)，OPF組大鼠血清NO水平和雌激素水平均較SOF組大鼠顯著下降。 4．對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠分別給予不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<

9、,1-34>，密鈣息，福善美，于藥物治療后l周，2周，4周，8周和12周，檢測(cè)左側(cè)股骨BMD值，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)股骨BMD值呈增高趨勢(shì)，與骨質(zhì)疏松性骨折模型組大鼠相比前4周各時(shí)間段左側(cè)股骨BMD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至治療后8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。X線觀察和組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-arginine，易維特，密鈣息，福善美等骨吸收抑制劑，可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期的間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞；粒細(xì)胞、單核．巨噬細(xì)胞等細(xì)胞聚集，毛細(xì)血管增生，纖

10、維骨痂形成增多；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序。骨折愈合晚期減少破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞骨吸收；至藥物治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，骨重建較好。PTH可以在骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期促進(jìn)血腫機(jī)化，纖維骨痂形成增多；增強(qiáng)成骨細(xì)胞數(shù)量和成骨細(xì)胞功能活性，骨量增加明顯，新生骨小梁排列較緊密，有序，骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)量多，破骨細(xì)胞吸收明顯；至治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，外骨痂較多，骨重建現(xiàn)象活躍。骨質(zhì)疏松

11、性骨折大鼠經(jīng)L-arginine，易維特，密鈣息和福善美藥物治療后，血清BAP和CTX水平呈下降趨勢(shì)，且在4周后與骨質(zhì)疏松性骨折模型組相比明顯下降，而福善美組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清CTX水平于治療后2周即較對(duì)照組明顯下降；rhPTH<,1-34>組大鼠血清BAP水平呈升高趨勢(shì)，4周后明顯高于對(duì)照組組血清BAP水平，血清CTX水平無(wú)明顯變化，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于藥物治療后12周時(shí)，血清NO水平均較對(duì)照組大鼠顯著升高。 結(jié)

12、論 1．實(shí)驗(yàn)證明PTH和L-argnine均明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂增殖，提高成骨細(xì)胞功能活性。而當(dāng)PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時(shí)，是利于成骨細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的最佳濃度，且促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)量最大。當(dāng)L-arginine濃度為0.6g／L時(shí)，成骨細(xì)胞表達(dá)iNOS及eNOS的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，由此進(jìn)一步說(shuō)明L-arginine濃度為0.6g／L是促進(jìn)成骨細(xì)胞功能的最佳濃度。 2．采用骨

13、髓誘導(dǎo)方法培養(yǎng)得到的破骨細(xì)胞數(shù)量較多，純度較高，且具有明顯的骨吸收功能。不同濃度的L-arginine加入破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系后，經(jīng)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)和骨吸收陷窩定量分析后，發(fā)現(xiàn)0.3g／L的L-atginine即明顯抑制破骨細(xì)胞的形成，并降低破骨細(xì)胞骨吸收功能，隨著L-arginine濃度的升高，這種抑制破骨細(xì)胞的作用更加明顯。 3．通過(guò)成功建立骨質(zhì)疏松性股骨中段骨折發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松后明顯影響骨折愈合，骨折后早

14、期骨折斷端的成骨細(xì)胞形成減少，血腫機(jī)化延遲；骨折愈合的中晚期軟骨性骨痂生成量增多，但向骨性骨痂演變過(guò)程延緩，破骨細(xì)胞骨吸收活躍，骨礦物沉積減少，骨痂質(zhì)量下降，骨質(zhì)疏松性骨折愈合明顯延遲，對(duì)臨床具有明顯重要的指導(dǎo)意義。 NOS在骨質(zhì)疏松性骨折愈合的不同時(shí)期表達(dá)具有類型特異性和時(shí)間依賴性。iNOS和eNOS在骨質(zhì)疏松性骨折愈合的不同時(shí)期，它們表達(dá)的強(qiáng)弱也有所不同。 血清BAP和CTX的變化可以早期反映骨質(zhì)疏松性骨折骨代謝變化

15、的特點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便易行，靈敏度高等特點(diǎn)。通過(guò)測(cè)量血清BAP和CTX的水平，可以判斷骨質(zhì)疏松性骨折時(shí)骨重建情況，監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松性骨折的治療。 4．實(shí)驗(yàn)研究首次證明L-arginine促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合早期的炎癥細(xì)胞聚集，毛細(xì)血管增生，血腫機(jī)化；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序，增加骨量。骨折愈合晚期減少破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞骨吸收，使骨重建平衡，加速骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，提高骨折愈合質(zhì)量。L-arginine促進(jìn)骨