人臍帶間充質(zhì)干細胞與聚酸酐載體體外共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、目的:從人臍帶中分離、純化、培養(yǎng)原代臍帶間充質(zhì)干細胞(MSCs),對其表面標志物進行鑒定、傳代培養(yǎng)、誘導(dǎo)其向肝樣細胞分化。觀察分化的肝樣細胞和聚酸酐復(fù)合載體支架在體外能否共同培養(yǎng),肝樣細胞的生長狀態(tài),評價聚酸酐復(fù)合載體支架對肝樣細胞生物活性的影響。
　　 方法:無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,將臍血管經(jīng)過處理后,在培養(yǎng)皿內(nèi)剪碎至1mm3,然后移入培養(yǎng)瓶中,待細胞生長至80-90％融合時,按1:3傳代培養(yǎng),取傳代培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學(xué)

2、觀察、免疫細胞化學(xué)染色、流式細胞儀檢測其生長活性、并進行細胞周期分析。將第六代的人臍帶MSCs接種在放有支架的24孔板上培養(yǎng),同時設(shè)置對照組。A組:人臍帶MSCs,加入HGF等誘導(dǎo)因子。B組:人臍帶MSCs,不加入任何誘導(dǎo)因子。C組:支架培養(yǎng)的人臍帶MSCs,不加入任何誘導(dǎo)因子。D組:與支架培養(yǎng)的人臍帶MSCs,加入HGF等誘導(dǎo)因子。在不同誘導(dǎo)階段收集細胞后觀察細胞形態(tài)。在誘導(dǎo)4周后取平板細胞上清液進行生化檢測,主要項目包括:CYP45

3、0的活性、Albumin和尿素的含量。同時支架進行石蠟包埋,進行切片,HE染色觀察誘導(dǎo)后的肝樣細胞在支架中的生長情況,行免疫組織化學(xué)觀察肝細胞的表面標志:CK19、AFP、ALB和C-Kit。
　　 結(jié)果:經(jīng)組織塊培養(yǎng)法可從臍帶中獲得MSCs,數(shù)量約1x108。觀察細胞形態(tài)為長梭形,不規(guī)則形,細胞大小不一,類似成纖維細胞,呈漩渦樣生長。取第6-9代細胞行免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示細胞強表達CD105、Vimentin,基本不表達C

4、D34、CD31、CD133。經(jīng)流式細胞儀檢測表達CD105(97.4±5％)、CD29(71.1±2.0％),基本不表達造血細胞標志CD34(1.6±0.4％)。MTT實驗顯示細胞倍增時間為22h。細胞周期分析表明75％-85％細胞處于G0/G1。HE染色結(jié)果顯示,誘導(dǎo)以后肝樣細胞與支架生長良好；檢測細胞上清液顯示:D組細胞分泌的CYP450(4.205±0.760 pg/ml)、Albumin(0.230±0.035g/dl)、尿素

5、(2.630±0.262 mg/dl)的含量與A、B和C組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),免疫組織化學(xué)顯示誘導(dǎo)組支架材料上Album、CK-19、AFP、C-Kit呈陽性反應(yīng)。
　　 結(jié)論:經(jīng)組織塊培養(yǎng)法可從臍帶中獲得間充質(zhì)干細胞,符合間充質(zhì)干細胞基本的生物學(xué)特性。臍帶間充質(zhì)干細胞在HGF等誘導(dǎo)因子作用下可轉(zhuǎn)化為肝樣細胞,初步具備肝細胞特有的功能性特征。肝樣細胞與復(fù)合載體經(jīng)過連續(xù)30天共同培養(yǎng),肝樣細胞可以很好的貼附于聚酸酐復(fù)