慢病毒介導(dǎo)的人堿性纖維生長因子基因的構(gòu)建及在鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討構(gòu)建攜帶人堿性成纖維生長因子(bFGF)的重組慢病毒載體方法并觀察堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后bFGF目的基因的表達(dá)情況。
　　 方法：采用RT-PCR擴(kuò)增的方法獲取人源性的bFGF與FGF4基因，將目的基因與載體pGC-FU連接[含綠色熒光蛋白(GFP)]。產(chǎn)生pGC FU-FGF4-bFGF慢病毒載體。PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。通過lipofectamine2000的介導(dǎo)把pGC FU-

2、FGF4-bFGF載體，pHelper1.0載體和pHelper2.0載體三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞293T.應(yīng)用Real time-PCR法鑒定和測定滴度。而后轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并檢測其表達(dá)。MTT法檢測到間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過基因修飾以后和未經(jīng)過基因修飾的干細(xì)胞生長情況
　　 結(jié)果：⑴流式細(xì)胞儀顯示體外分離培養(yǎng)的第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)：CD11b/c陽性細(xì)胞表達(dá)率為14.2％±0.7％，CD34陽性細(xì)胞表達(dá)率為1

3、.3％±0.5％，CD44陽性細(xì)胞表達(dá)率97.8％±0.9％，CD90陽性細(xì)胞表達(dá)率96.9％±1.5％。⑵PCR鑒定證實(shí)重組慢病毒有人FGF4信號肽-人BFGF，病毒滴度為2.00E+9 TU/ml。⑶轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，行RT-PCR檢測到BFGF基因轉(zhuǎn)入干細(xì)胞內(nèi)，其大小約500bp。⑷在熒光顯微鏡下，觀察到轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)；通過Western Blot檢測轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以觀察到36～55KDr之間有明顯表達(dá)，與FG

4、F4-BFGF-GFP融合蛋白(~21+28KDr=~49KDr)基本吻合。(備注：構(gòu)建的pGC-FU-FGF4-BFGF基因插入片斷大小549bp)綜上：基本判斷FGF4-BFGF表達(dá)正常。ELISA檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染bFGF的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中堿性成纖維細(xì)胞生長因子濃度顯著高于空白對照。⑸MTT法檢測到間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過基因修飾以后和未經(jīng)過基因修飾的干細(xì)胞生長情況對比，基因修飾后的目的細(xì)胞明顯優(yōu)于未經(jīng)修飾的干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：成