不同分化狀態(tài)的間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的趨化性遷移研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有擴(kuò)散和浸潤(rùn)的特性，即使經(jīng)過外科手術(shù)切除，并輔以放療或化療，也難以徹底治愈。因此，需要新的治療方法來(lái)追蹤逃離常規(guī)治療的散在瘤細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，而且能夠趨向膠質(zhì)瘤及多種趨化因子遷移，從而成為治療膠質(zhì)瘤的理想載體細(xì)胞。然而MSCs定向遷移的機(jī)制還不是完全清楚，尤其是MSCs分化狀態(tài)與遷移之間關(guān)系的研究還未見報(bào)道。本實(shí)

2、驗(yàn)旨在研究不同分化狀態(tài)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的趨化性遷移。
　　 本研究首先采用PercoⅡ密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMSCs，體外擴(kuò)增培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性，免疫熒光染色，成骨、成脂誘導(dǎo)分化，對(duì)BMSCs進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的BMSCs為長(zhǎng)梭形，增

3、殖速度快，表面抗原CD29、CD90、CD106呈陽(yáng)性，CD34、CD45為陰性，并且體外能夠誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有多向分化潛能的BMSCs。
　　 隨后通過丁羥基茴香醚(butyl hydroxy anisol，BHA)聯(lián)合堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)BMSCs成神經(jīng)分化，即先用10ng/mlbFGF預(yù)誘導(dǎo)24 h，再用200μ

4、M BHA和2％DMSO誘導(dǎo)5 h，最后用含有N2的H-DMEM維持培養(yǎng)。觀察該過程中細(xì)胞的形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin、β-Ⅲ-tubulin及NSE的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，未分化BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣；預(yù)誘導(dǎo)24 h后，胞體稍有收縮，邊緣變得不齊整：誘導(dǎo)5 h，胞體收縮成圓形或橢圓形，折光性強(qiáng)，有突起伸出；維持培養(yǎng)18 h后，細(xì)胞出現(xiàn)3個(gè)或更多突起；維持培養(yǎng)48 h，細(xì)胞突起更為復(fù)雜，出現(xiàn)二級(jí)分叉，

5、突起長(zhǎng)度增加，與其他細(xì)胞的突起相互接觸。免疫熒光染色顯示，nestin與β-Ⅲ-tubulin的表達(dá)都呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，均在誘導(dǎo)5 h時(shí)達(dá)到最高值，之后顯著下降；而NSE陽(yáng)性細(xì)胞比率在誘導(dǎo)期以及維持前期都很低，到維持48 h顯著升高；GFAP在整個(gè)誘導(dǎo)分化過程中始終為陰性。
　　 接著運(yùn)用Dunn chamber裝置研究了BMSCs及成神經(jīng)分化不同狀態(tài)BMSCs向HGF的趨化性遷移，計(jì)算細(xì)胞遷移速率和遷移效率。結(jié)果顯示，

6、在趨化性遷移實(shí)驗(yàn)中，即外槽加入不同濃度HGF、內(nèi)槽只加L-DMEM時(shí)，細(xì)胞的遷移速率沒有變化，遷移效率隨著HGF濃度的增加而增高；與對(duì)照組(內(nèi)外槽均只加入L-DMEM)相比，50 ng/ml及100 ng/ml HGF均顯著提高了細(xì)胞的遷移效率，但兩者之間沒有差異。當(dāng)內(nèi)外槽均加入50 ng/ml HGF，細(xì)胞的遷移速率及遷移效率與對(duì)照相比無(wú)差異，表明HGF能夠誘導(dǎo)BMSCs定向遷移。接著我們研究了成神經(jīng)分化的BMSCs向HGF的趨化性遷

7、移，結(jié)果顯示外槽加入50 ng/ml HGF未能改變分化各點(diǎn)細(xì)胞的遷移速率，但顯著提高了未分化、預(yù)誘導(dǎo)24 h、誘導(dǎo)5 h及維持48 h細(xì)胞的遷移效率，表明成神經(jīng)分化的BMSCs向HGF的趨化遷移能力與其分化狀態(tài)密切相關(guān)。用P13K抑制劑LY294002(30μM)預(yù)處理1 h的BMSCs進(jìn)行趨化遷移實(shí)驗(yàn)，外槽加入HGF后，細(xì)胞遷移效率與未處理組細(xì)胞相比顯著降低，即LY294002阻斷了HGF誘導(dǎo)BMSCs的定向遷移，證明P13K信號(hào)通

8、路參與介導(dǎo)HGF誘導(dǎo)BMSCs的定向遷移過程。
　　 最后，通過改變Racl的表達(dá)水平，觀察BMSCs隨機(jī)遷移行為及HGF誘導(dǎo)的定向遷移行為的變化。發(fā)現(xiàn)Racl過表達(dá)后，BMSCs遷移速率及趨向HGF的遷移效率顯著提高；干擾Racl表達(dá)后，遷移速率及趨向HGF的遷移效率顯著降低。結(jié)果表明Racl調(diào)節(jié)BMSCs的遷移速率，并且參與介導(dǎo)HGF誘導(dǎo)BMSCs的定向遷移過程。
　　 以上結(jié)果表明，HGF能夠趨化BMSCs的定向遷