2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、惡性膠質(zhì)瘤是目前顱內(nèi)最為常見的原發(fā)腦瘤,它具有極強(qiáng)的浸潤(rùn)和擴(kuò)散的特性。目前,最常用的治療手段無非外科手術(shù)切除和放療或化療的結(jié)合,但效果并不盡如人意,而干細(xì)胞移植極有希望治療膠質(zhì)瘤。因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體內(nèi)體外均顯示很強(qiáng)的膠質(zhì)瘤趨化性及可以向多種趨化因子( SDF、SCF、VEGF、HGF)遷移,并且具有多向分化潛能,所以應(yīng)用BMSCs治療膠質(zhì)瘤即是很好的細(xì)胞

2、治療手段。本實(shí)驗(yàn)旨在研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)不同分化狀態(tài)下BMSCs的遷移以及相關(guān)信號(hào)通路MAPK和PI3K/Akt的影響。并且,我們還進(jìn)一步研究了HGF對(duì)不同分化狀態(tài)下BMSCs的細(xì)胞骨架系統(tǒng)的變化以及磷酸化ERK1/2入核的情況。
   本研究首先采用Percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMSCs,體外擴(kuò)增培養(yǎng),通過觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性,免疫熒光染色,成骨、成脂誘導(dǎo)分化,對(duì)BMSCs進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,分離

3、培養(yǎng)的BMSCs為長(zhǎng)梭形,增殖速度快,表面抗原CD29、CD90、CD106呈陽性,CD34、CD45為陰性,并且體外能夠誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞,證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有多向分化潛能的BMSCs。
   隨后將傳到3代以上的細(xì)胞作為純度較高的BMSCs用作實(shí)驗(yàn)材料,以2×104/ml的密度接種于35 mm2培養(yǎng)皿,培養(yǎng)皿中預(yù)先放置包被有0.05%多聚賴氨酸的蓋玻片,待細(xì)胞貼壁后,通過丁羥基茴香醚(butyl hydroxy

4、 anisol,BHA)聯(lián)合堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)誘導(dǎo)BMSCs成神經(jīng)分化,即先用10 ng/ml bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h,再用200μM BHA和2% DMSO誘導(dǎo)5h,最后用含有N2的H-DMEM維持培養(yǎng)。觀察該過程中細(xì)胞的形態(tài)變化,免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin、β-Ⅲtubulin及MAP2的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,未分化BMSCs呈成纖維細(xì)

5、胞樣;預(yù)誘導(dǎo)24h后,胞體稍有收縮,邊緣變得不齊整;誘導(dǎo)5h,胞體收縮成圓形或橢圓形,折光性強(qiáng),有突起伸出;維持培養(yǎng)18h后,細(xì)胞出現(xiàn)3個(gè)或更多突起;維持培養(yǎng)48h,細(xì)胞突起更為復(fù)雜,出現(xiàn)二級(jí)分叉,突起長(zhǎng)度增加,與其他細(xì)胞的突起相互接觸。免疫熒光染色顯示,nestin的表達(dá)在未分化間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)最高,隨著成神經(jīng)分化過程的進(jìn)行逐漸降低。而β-Ⅲ tubulin的表達(dá)在誘導(dǎo)5小時(shí)的細(xì)胞中開始出現(xiàn),維持18小時(shí)和48小時(shí)階段的細(xì)胞中有較弱的

6、表達(dá)。整個(gè)分化過程中,MAP2都沒有表達(dá)。
   接下來我們研究了不同分化狀態(tài)下MSCs向HGF的遷移效應(yīng)。我們首先利用Boyden chamber裝置研究不同分化狀態(tài)下BMSCs向不同濃度即0、5、25、50和100 ng/ml的HGF的遷移,先對(duì)未分化BMSC進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HGF誘導(dǎo)的BMSCs的遷移呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),HGF在50 ng/ml時(shí)細(xì)胞達(dá)到最大遷移數(shù)量,為了研究這一種遷移是化學(xué)趨化性還是化學(xué)機(jī)動(dòng)性引起的,我們

7、將上室和下室均加入相同濃度的HGF發(fā)現(xiàn)與對(duì)照L-DMEM相比無明顯差異,證實(shí)HGF誘導(dǎo)的遷移是化學(xué)趨化性引起的,接著我們對(duì)成神經(jīng)分化的不同階段細(xì)胞進(jìn)行群體性遷移研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),50 ng/ml的HGF均能引起各個(gè)狀態(tài)細(xì)胞明顯的遷移,25 ng/ml的HGF明顯引起了誘導(dǎo)5h、維持18h和48h階段細(xì)胞的遷移,我們也證實(shí)了這些分化階段細(xì)胞的遷移仍是化學(xué)趨化引起的。另外,我們還研究了不同分化階段細(xì)胞向同一濃度HGF遷移數(shù)量的比較,發(fā)現(xiàn)預(yù)誘導(dǎo)

8、24h階段的細(xì)胞向50 ng/mlHGF遷移的數(shù)量更多,相比其他分化階段有更明顯的趨化效應(yīng)。我們對(duì)遷移至膜下的細(xì)胞也進(jìn)行了免疫熒光染色的鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有的分化階段,遷移至膜下的細(xì)胞中nestin陽性的細(xì)胞占絕大多數(shù)。并且HGF明顯加強(qiáng)了nestin陽性細(xì)胞的遷移,而對(duì)β-Ⅲ tubulin陽性的細(xì)胞沒有明顯作用。另外,與先前的結(jié)果一致的是,50 ng/ml HGF明顯加強(qiáng)了預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)階段nestin陽性細(xì)胞的遷移。
  

9、 此外,我們還運(yùn)用Dunn chamber裝置研究了BMSCs及成神經(jīng)分化不同狀態(tài)下BMSCs向HGF的趨化性遷移,計(jì)算細(xì)胞遷移速率和遷移效率。結(jié)果顯示,在趨化性遷移實(shí)驗(yàn)中,即外槽加入不同濃度HGF、內(nèi)槽只加L-DMEM時(shí),相比誘導(dǎo)5h、維持18h及48h,未分化及預(yù)誘導(dǎo)24h細(xì)胞的遷移速度呈現(xiàn)明顯的加快。而當(dāng)內(nèi)外槽均加入50 ng/ml HGF,細(xì)胞的遷移速率及遷移效率與對(duì)照相比無差異。另外,我們還研究了成神經(jīng)分化各個(gè)階段細(xì)胞的遷移速

10、率,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):當(dāng)外槽都加入50 ng/ml的HGF時(shí),預(yù)誘導(dǎo)24h階段的細(xì)胞相比其他分化階段的細(xì)胞呈現(xiàn)出更高的遷移效率。
   MAPKs家族包括ERK1/2、p38MAPKs及SAPK/JNK,而Akt是PI3K信號(hào)通路的下游關(guān)鍵蛋白。已經(jīng)有很多文獻(xiàn)證實(shí)PI3K和MAPK信號(hào)通路參與體內(nèi)諸多生化反應(yīng)如細(xì)胞分裂、凋亡、分化及遷移。并且有文獻(xiàn)報(bào)道HGF可以激活一些重要的信號(hào)通路分子,如ERK1/2、PI3K/Akt和p38MAPK

11、。接下來我們應(yīng)用蛋白印跡檢測(cè)了HGF對(duì)不同分化狀態(tài)下BMSCs中ERK1/2、Akt、p38MAPK及SAPK/JNK表達(dá)的影響。首先,我們用不同濃度的HGF處理未分化狀態(tài)下的BMSCs,我們發(fā)現(xiàn)HGF誘導(dǎo)的ERK1/2、Akt和p38MAPK的磷酸化呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。而HGF對(duì)SAPK/JNK的磷酸化沒有影響。為了進(jìn)一步研究HGF對(duì)兩條信號(hào)通路的影響,我們選取了50ng/ml的HGF處理不同分化狀態(tài)下BMSCs不同時(shí)間后,觀察相關(guān)蛋白

12、的磷酸化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同分化狀態(tài)下的細(xì)胞均表達(dá)基底水平的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK,然而HGF所誘導(dǎo)的Akt的磷酸化的增加發(fā)生在未分化,預(yù)誘導(dǎo)24h和誘導(dǎo)5h階段,并且這種磷酸化的增加從15分鐘開始,一直持續(xù)到60分鐘。在未分化和預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)狀態(tài)的細(xì)胞中,HGF誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化的增加從5分中開始,15分鐘時(shí)達(dá)到峰值,而在30分鐘內(nèi)恢復(fù)到基底水平。而在誘導(dǎo)5小時(shí)、維持18小時(shí)和48小時(shí)的細(xì)胞中,

13、這種增強(qiáng)的ERK1/2的磷酸化會(huì)持續(xù)到60分鐘。對(duì)于p38MAPK的磷酸化,HGF刺激后,在未分化、預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)及誘導(dǎo)5小時(shí)的細(xì)胞中5分鐘時(shí)開始增加,15分鐘時(shí)達(dá)到峰值,而在維持18及48小時(shí)的細(xì)胞中卻沒有明顯變化。HGF刺激不同分化狀態(tài)的細(xì)胞后,SAPK/JNK增加的磷酸化發(fā)生在誘導(dǎo)5小時(shí)、維持18及48小時(shí)的細(xì)胞中。此外,我們也研究了五種狀態(tài)的細(xì)胞中的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK基底水平的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),

14、誘導(dǎo)5h和維持18h階段磷酸化的ERK1/2明顯高于其他階段的細(xì)胞。而磷酸化的Akt在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)最高,隨著細(xì)胞成神經(jīng)分化的誘導(dǎo),磷酸化的p38MAPK和SAPK/JNK的表達(dá)逐漸升高。
   最后,為了進(jìn)一步證實(shí)HGF誘導(dǎo)的不同狀態(tài)的細(xì)胞的遷移所參與的信號(hào)通路,我們引入了Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK信號(hào)分子的抑制劑LY294002、SB203580、PD98059和SP600125,即分

15、別用四種信號(hào)分子的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞向HGF的遷移情況。首先,利用Boyden chamber研究抑制劑預(yù)處理后細(xì)胞的群體遷移行為,發(fā)現(xiàn)PD98059阻斷ERK1/2后明顯的抑制了HGF誘導(dǎo)的所有狀態(tài)細(xì)胞的遷移,特異阻斷PI3K/Akt后,僅未分化階段的細(xì)胞向HGF的遷移受到抑制,而分化階段細(xì)胞的遷移沒有受到明顯抑制。當(dāng)p38MAPK被阻抑后,只影響了未分化、預(yù)誘導(dǎo)24h和誘導(dǎo)5h階段的細(xì)胞遷移,而SAPK/JNK被阻斷后,維持

16、18h和48h階段的細(xì)胞遷移相應(yīng)的受到了抑制。緊接著,我們又利用Dunnchamber裝置進(jìn)一步研究了抑制劑摻入后細(xì)胞在個(gè)體水平遷移速度和遷移效率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ERK1/2被抑制后,所有狀態(tài)細(xì)胞的遷移速度及效率都受到了明顯的抑制。抑制PI3K/Akt后明顯抑制了未分化和預(yù)誘導(dǎo)24h階段細(xì)胞的遷移速度及未分化、預(yù)誘導(dǎo)24h和誘導(dǎo)5h階段細(xì)胞的遷移效率。阻斷p38MAPK后,未分化、預(yù)誘導(dǎo)24h和誘導(dǎo)5h階段的細(xì)胞遷移速度及遷移效率均明

17、顯降低。對(duì)于SAPK/JNK受到抑制后,誘導(dǎo)5h,維持18h和48h細(xì)胞的遷移速度及遷移效率都明顯下降了。以上結(jié)果說明不同信號(hào)通路的分子在特定狀態(tài)的細(xì)胞向HGF的遷移中發(fā)揮了重要的作用。
   細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞遷移是密切相關(guān)的。并且,當(dāng)細(xì)胞所處環(huán)境存在趨化物時(shí),細(xì)胞遷移需要極性的改變,并且細(xì)胞遷移的能力很大程度上取決于細(xì)胞骨架重組的能力。因此,我們也分析了HGF刺激后不同分化狀態(tài)下BMSCs細(xì)胞骨架的重組。我們發(fā)現(xiàn)處于未分化

18、及預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)階段的細(xì)胞在HGF刺激0.5 min時(shí)骨架便開始明顯發(fā)生重組,細(xì)胞周邊出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白聚集而形成的尾足;而在誘導(dǎo)5小時(shí)細(xì)胞中,細(xì)胞骨架的重組發(fā)生在HGF刺激后大約1min,在維持18h和48h階段的細(xì)胞中,細(xì)胞骨架的重組發(fā)生在HGF刺激后大約1.5min,這說明隨著分化的進(jìn)行細(xì)胞骨架的重組對(duì)HGF的刺激敏感性下降。
   綜上,HGF能夠趨化不同分化狀態(tài)下BMSCs的定向遷移,PI3K/Akt和MAPKs信號(hào)通路參與

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