抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)多柔比星致心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:通過抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)旁分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)對(duì)多柔比星(DOX)受損心肌細(xì)胞的作用,觀察心肌細(xì)胞凋亡水平的改變,并探索其可能機(jī)制,為進(jìn)一步提高M(jìn)SCs移植治療的有效性提供理論依據(jù)。
　　 方法:(1)用酶消化法和差速貼壁法分離、純化新生SD大鼠心肌細(xì)胞。用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠MSCs。(2)用不同濃度DOX(0.5、1、2μmol/L)處理培養(yǎng)第3天的心肌細(xì)胞,對(duì)各濃度組的不同時(shí)間點(diǎn)

2、(4、12、24、48h)進(jìn)行檢測(cè),建立DOX心肌細(xì)胞損傷的體外模型。(3)將培養(yǎng)第3天的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組:A組,正常對(duì)照組;B組,DOX損傷組;C組,TGF-β1干預(yù)組。同時(shí)建立MSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系,并分為三組:D組,DOX損傷組;E組,DOX損傷+4MSCs共培養(yǎng)組;F組,DOX損傷+MSCs+LY364947(TGF-β1受體特異性抑制劑)共培養(yǎng)組。(4)α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SA)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定心肌細(xì)胞純度

3、,流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第三代的MSCs的表面標(biāo)志CD90和CD45。MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率,ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞和MSCs上清中TGF-β1的濃度,Westernblot法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Caspase-9的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)用酶消化法和差速貼壁法可分離獲得狀態(tài)良好、純度高的心肌細(xì)胞,培養(yǎng)第三天的心肌細(xì)胞純度達(dá)90%。用全骨髓貼壁法可獲得純度高、活力

4、好的MSCs,培養(yǎng)第三代的MSCs純度達(dá)90%。(2)和正常心肌細(xì)胞相比,2μmol/LDOX誘導(dǎo)4h即可使心肌細(xì)胞存活率顯著下降[(80.53±1.92)%vs100%,P＜0.01];2μmol/LDOX可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,在4h～48h內(nèi)細(xì)胞凋亡率不斷增加[對(duì)照組(1.394±0.18)%、4h組(3.65±0.49)%、12h組(8.54±0.64)%、24h組(11.70±1.62)%、48h組(17.80±1.67)%,P＜

5、0.05];2μmol/LDOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞4h后,TGF-β1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異[(2.37±0.21)ng/Lvs(2.23±0.15)ng/L,P＞0.05],而在12h～48h內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯增加[12h組(2.71±0.12)ng/L,24h組(3.16±0.46)ng/L,48h組(3.60±0.18)ng/L,P＜0.05],且與心肌細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān),r=0.932。(3)與A組相比,B組心肌細(xì)

6、胞凋亡率增加[(49.15±7.05)vs(27.03±4.43)%,P＜0.05];而加入TGF-β1后,C組較B組心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加[(71.70±5.17)vs(49.15±7.05)%,P＜0.05]。(4)第三代的MSCs可分泌一定量的TGF-β1,檢測(cè)細(xì)胞上清中TGF-β1的濃度為(3.27±0.31)ng/L。(5)成功建立MSCs與DOX損傷心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TGF-β1的含量:E

7、組較D組TGF-β1表達(dá)量增加[(5.33±0.55)vs(2.78±0.14)ng/L,P＜0.05],F組較E組TGF-β1表達(dá)量減少[(3.41±0.46)vs(5.33±0.55)ng/L,P＜0.05]。AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率:E組較D組心肌細(xì)胞凋亡率下降[(60.70±2.20)vs(69.84±2.84)%,P＜0.05],F組較E組凋亡率進(jìn)一步下降[(51.58±5.11)vs(

8、60.70±2.20)%,P＜0.05]。WesternBlot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)水平:E組較D組Caspase-9蛋白表達(dá)水平下降[(0.587±0.003)vs(0.671±0.005),P＜0.05],F組較E組Caspase-9蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步下降[(0.456±0.002)vs(0.587±0.003),P＜0.05]。
　　 結(jié)論:MSCs可以通過旁分泌效應(yīng)減少DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡,但其