抑制骨髓間充質干細胞旁分泌轉化生長因子-β1對多柔比星致心肌細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:通過抑制骨髓間充質干細胞(MSCs)旁分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)對多柔比星(DOX)受損心肌細胞的作用,觀察心肌細胞凋亡水平的改變,并探索其可能機制,為進一步提高MSCs移植治療的有效性提供理論依據(jù)。
　　 方法:(1)用酶消化法和差速貼壁法分離、純化新生SD大鼠心肌細胞。用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠MSCs。(2)用不同濃度DOX(0.5、1、2μmol/L)處理培養(yǎng)第3天的心肌細胞,對各濃度組的不同時間點

2、(4、12、24、48h)進行檢測,建立DOX心肌細胞損傷的體外模型。(3)將培養(yǎng)第3天的心肌細胞隨機分為三組:A組,正常對照組;B組,DOX損傷組;C組,TGF-β1干預組。同時建立MSCs與心肌細胞共培養(yǎng)體系,并分為三組:D組,DOX損傷組;E組,DOX損傷+4MSCs共培養(yǎng)組;F組,DOX損傷+MSCs+LY364947(TGF-β1受體特異性抑制劑)共培養(yǎng)組。(4)α-橫紋肌肌動蛋白(α-SA)免疫細胞化學染色法鑒定心肌細胞純度

3、,流式細胞儀檢測培養(yǎng)第三代的MSCs的表面標志CD90和CD45。MTT法檢測心肌細胞存活率,流式細胞術AnnexinV/PI雙染法檢測各組心肌細胞凋亡率,ELISA法檢測心肌細胞和MSCs上清中TGF-β1的濃度,Westernblot法檢測各組心肌細胞Caspase-9的蛋白表達。
　　 結果:(1)用酶消化法和差速貼壁法可分離獲得狀態(tài)良好、純度高的心肌細胞,培養(yǎng)第三天的心肌細胞純度達90%。用全骨髓貼壁法可獲得純度高、活力

4、好的MSCs,培養(yǎng)第三代的MSCs純度達90%。(2)和正常心肌細胞相比,2μmol/LDOX誘導4h即可使心肌細胞存活率顯著下降[(80.53±1.92)%vs100%,P＜0.01];2μmol/LDOX可誘導心肌細胞凋亡,在4h～48h內細胞凋亡率不斷增加[對照組(1.394±0.18)%、4h組(3.65±0.49)%、12h組(8.54±0.64)%、24h組(11.70±1.62)%、48h組(17.80±1.67)%,P＜

5、0.05];2μmol/LDOX誘導心肌細胞4h后,TGF-β1蛋白表達量與對照組之間無明顯差異[(2.37±0.21)ng/Lvs(2.23±0.15)ng/L,P＞0.05],而在12h～48h內TGF-β1蛋白表達量明顯增加[12h組(2.71±0.12)ng/L,24h組(3.16±0.46)ng/L,48h組(3.60±0.18)ng/L,P＜0.05],且與心肌細胞凋亡率呈正相關,r=0.932。(3)與A組相比,B組心肌細

6、胞凋亡率增加[(49.15±7.05)vs(27.03±4.43)%,P＜0.05];而加入TGF-β1后,C組較B組心肌細胞凋亡率進一步增加[(71.70±5.17)vs(49.15±7.05)%,P＜0.05]。(4)第三代的MSCs可分泌一定量的TGF-β1,檢測細胞上清中TGF-β1的濃度為(3.27±0.31)ng/L。(5)成功建立MSCs與DOX損傷心肌細胞的共培養(yǎng)體系。ELISA法檢測各組細胞上清中TGF-β1的含量:E

7、組較D組TGF-β1表達量增加[(5.33±0.55)vs(2.78±0.14)ng/L,P＜0.05],F組較E組TGF-β1表達量減少[(3.41±0.46)vs(5.33±0.55)ng/L,P＜0.05]。AnnexinV-FITC/PI流式細胞儀檢測各組心肌細胞凋亡率:E組較D組心肌細胞凋亡率下降[(60.70±2.20)vs(69.84±2.84)%,P＜0.05],F組較E組凋亡率進一步下降[(51.58±5.11)vs(

8、60.70±2.20)%,P＜0.05]。WesternBlot檢測各組心肌細胞Caspase-9蛋白表達水平:E組較D組Caspase-9蛋白表達水平下降[(0.587±0.003)vs(0.671±0.005),P＜0.05],F組較E組Caspase-9蛋白表達水平進一步下降[(0.456±0.002)vs(0.587±0.003),P＜0.05]。
　　 結論:MSCs可以通過旁分泌效應減少DOX引起的心肌細胞凋亡,但其