人毛乳頭細胞HSPC016基因的克隆、表達和鑒定.pdf

1、毛囊是重要的皮膚附屬器官，是毛發(fā)的主體。毛發(fā)具有調節(jié)體溫、排泄代謝物、緩沖外界機械壓力等重要生理功能，對人類而言同時還有美學、裝扮、特征辨認等社會學意義。因毛囊異常生長所致的多毛或少毛不僅會影響毛發(fā)生理功能的正常發(fā)揮而且正在或可能將要給越來越多的患者造成心理壓力，直接影響患者的健康和生活質量。因此，了解毛囊生長的確切機制、調控原理及探討臨床診治毛囊疾病的方法與措施已成必然。多數(shù)學者認為毛乳頭在毛囊的形態(tài)學發(fā)生和成年毛囊的周期性生長與調控

2、中起主導作用，毛乳頭細胞是毛囊研究的中心環(huán)節(jié)之一。造血干細胞(hematopoieticstem/progenitorcell，HSPC)相關基因HSPC016是我國復旦大學學者在人造血干細胞中發(fā)現(xiàn)的新基因，而我們首次發(fā)現(xiàn)了HSPC016基因作為上調表達基因在凝集性生長狀態(tài)人毛乳頭細胞差異表達cDNA文庫中的表達。對于一個新基因而言，獲取其重組蛋白，是進一步對基因功能進行深入研究所必需的。 毛囊的明顯特性是自我更新和周期性生長。

3、完整的毛囊生長周期包括生長期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)。毛囊的胚胎發(fā)育和周期性生長主要依靠來源于毛囊上皮與間質毛乳頭(dermalpapillae，DP)的相互作用。毛乳頭是真皮成分突入毛球內形成的特殊結構，為含血管和神經(jīng)的間充質成分。毛乳頭細胞(dermalpapillacells，DPC)是組成毛乳頭的唯一細胞，在毛囊的胚胎發(fā)生和周期性生長過程中起著十分重要的作用，一方面提供毛囊生長和分化必

4、需的信號因子和營養(yǎng)支持，另一方面還決定毛囊的分化方向。因此，毛乳頭細胞是毛囊研究的中心環(huán)節(jié)之一。 毛乳頭是一個可誘導的結構，它能發(fā)送或接受信號，從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長。通過對小鼠/大鼠模型的研究，一些與毛囊生長周期有關的調節(jié)分子如成纖維細胞生長因子(fibobalastgrowthfactors，F(xiàn)GFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)、刺猬蛋白(sonichedgeho

5、g，Shh)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophins)、血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)等已相繼被鑒定出來。組成毛囊的細胞如DPC、外根鞘細胞(outrootsheath，ORS)、毛母質細胞等可分泌這些生長因子及其受體；而且就單一細胞因子而言，其產(chǎn)生和分泌都與毛囊周期的特定時相有關。但是，關于這些細胞因子調節(jié)毛囊胚胎發(fā)生和毛囊生長周期的具體分子機制如通過什么信號轉導途徑、與什么分

6、子作用等均不十分清楚。Inamatsu等在實驗中發(fā)現(xiàn)凝集生長狀態(tài)的DPC仍能保持誘導毛囊發(fā)生的能力。為了探索哪些基因在DPC凝集生長狀態(tài)下表達，篩選與DPC凝集生長相關的基因，宋志強博士、郝飛教授等應用抑制性消減雜交技術成功地建立了凝集性生長的人毛乳頭細胞差異表達基因cDNA文庫，并從凝集生長狀態(tài)的人毛乳頭細胞篩選出一批上調表達和下調表達基因。HSPC016即是通過上述方法篩選出的與DPC凝集生長相關的基因，它被首次從CD34+造血干細

7、胞/祖細胞(CD34+hematopoieticstem/progenitorcells，HSPC)中分離鑒定，但功能不清。鑒于DPC具有干細胞的特點，如自我更新、凝集性生長、處于受保護的隱蔽位置、血供豐富等，有學者將DPC轉化為紅系及髓系血細胞觀察發(fā)現(xiàn)在動物體內可維持達1年之久，我們推測HSPC016對維持DPC凝集性生長及其功能可能發(fā)揮重要作用?；谏鲜鰲l件和原因，本實驗對HSPC016基因的ORF序列進行克隆并分別在大腸桿菌和畢赤

8、酵母中誘導表達，通過獲取其重組蛋白，為下一步對該基因功能進行深入研究打下基礎。 本課題研究結果顯示，用PCR技術成功地克隆出人毛乳頭細胞HSPC016基因的功能序列，由195bp組成并與GenBank公布序列完全一致。所構建的原核表達載體pET-28a(+)/HSPC016轉化工程菌E.coliBL21并經(jīng)誘導后，SDS-PAGE電泳鑒定：目的蛋白Mr約為7.2kDa，與理論預測值相吻合；UVP掃描表明目的蛋白表達率約20％；N

9、-端氨基酸測序結果與預期序列完全一致。將初步純化的蛋白免疫家兔獲得兔抗HSPC016血清，ELISA檢測顯示血清滴度為320,000EU。真核表達載體pPIC9K/HSPC016轉化GS115用G418-YPD平板篩選高拷貝轉化子，經(jīng)甲醇誘導表達，SDS-PAGE電泳鑒定：目的蛋白相對分子量(Mr)約為7.2kDa，與理論預測值相吻合；UVP掃描表明目的蛋白表達率約11.7％；Westernblot檢測具有良好的免疫反應性；N-端氨基酸