黑乳海參膠原蛋白活性肽的研究.pdf

1、海參(sea cucumber, holothurians)歸屬無(wú)脊椎動(dòng)物棘皮動(dòng)物門,以其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥學(xué)價(jià)值而被列為“八珍”之一。全世界約有1000多種海參,我國(guó)約有140多種,可供食用者約有40多種,其中10種具有較高的商品價(jià)值。黑乳海參( Holothuria nobilis Selenka)分布于我國(guó)西沙群島和海南島南部,澳大利亞西部海域,是一種品質(zhì)優(yōu)良的大型食用海參,體壁較厚。
　　目前國(guó)內(nèi)外對(duì)海參活性成分的研究主要

2、集中于海參多糖、海參皂苷、脂質(zhì)以及微量元素等,對(duì)海參膠原蛋白及其活性肽的研究較少。崔鳳霞等人對(duì)海參膠原蛋白活性肽進(jìn)行了一些研究,但大都集中在相對(duì)分子質(zhì)量為1000左右小分子肽的研究上,而對(duì)大分子膠原蛋白肽的研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　本論文以黑乳海參為研究對(duì)象,采用風(fēng)味酶對(duì)處理后的黑乳海參進(jìn)行酶解制備膠原蛋白活性多肽,結(jié)合各種分離技術(shù)提取純化膠原蛋白多肽,研究其氨基酸組成、氨基酸序列和體內(nèi)外的各種生理活性。本文主要研究結(jié)果如下:
　

3、?、秉\乳海參膠原蛋白酶解制備得到目標(biāo)膠原多肽HNCP-F-A(Mw:1-10kDa),采用超濾、凝膠柱層析和HPLC方法,分離制備得到三個(gè)組分:HNCP-F-Aa、HNCP-F-Ab、HNCP-F-Ac,采用MALDI-TOF-MS測(cè)得三個(gè)組分的多肽質(zhì)量圖譜及主要相對(duì)分子質(zhì)量:2806Da、7201Da、1532Da。
　?、材繕?biāo)膠原多肽的氨基酸組成分析結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備得到的黒乳海參膠原多肽主要含有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Al

4、a)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Hyp)。其中鮮味氨基酸、藥效氨基酸、必需氨基酸的總量占膠原多肽氨基酸總量的摩爾百分比分別為65.1％、58.08%、24.96%。因此黒乳海參膠原多肽氨基酸組成齊全,味道鮮美,具有很高藥用價(jià)值。
　?、巢捎肕ALDI-TOF/TOF MS-MS方法對(duì)黒乳海參膠原多肽樣品HNCP-F-Ac中8種多肽進(jìn)行denovo氨基酸測(cè)序,序列結(jié)果分別為:IPGYIMSSSNHDGGAP;GS

5、NHSDSY-WLMPR;PDMGVNSKYVGHLR;TMLAMVRVHLYLR;DGNLYMGHRMMCSGY;DWEV-AYDV HECPMCK;GDPKDDLFWVVCCKCLK。黒乳海參膠原多肽樣品HNCP-F-Ab條帶1的部分氨基酸序列為:NH2-Gly-Ala–Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Met-Met-Gly。
　?、春谌楹⒛z原多肽對(duì)二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)﹑羥基自由基(·0H)﹑超氧陰離子

6、自由基(O2·–)的清除作用表明,黑乳海參膠原多肽能有效清除二苯代苦味肼基自由基﹑羥基自由基﹑超氧陰離子自由基,其IC50值分別為5.78mg/ml﹑4.20mg/ml、0.27mg/ml。
　?、岛谌楹⒛z原多肽對(duì)D-半乳糖模型小鼠體內(nèi)的生理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:①對(duì)小鼠體重、免疫器官和臟器指數(shù)的影響:不同給藥劑量組,對(duì)其體重、免疫器官、臟器指數(shù)的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。②對(duì)小鼠血清、皮膚組織抗氧化水平和羥脯氨酸含量影響

7、:與D-gal組相比,在25mg/kg和50mg/kg兩個(gè)劑量組時(shí),血清中的T-AOC(總抗氧化能力)活性均顯著性增加(P<0.05),SOD(超氧化物歧化酶)的活性在25mg/kg劑量組時(shí)有非常顯著性的提高(P<0.01)。不同劑量的海參膠原多肽樣品對(duì)小鼠皮膚中的GSH-Px(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、T-AOC(總抗氧化能力)活性有雙向調(diào)節(jié)作用。與D-gal組相比,在50mg/kg劑量組時(shí),GSH-Px、SOD

8、、T-AOC活性均顯著性提高(P<0.05),尤其是GSH-Px和T-AOC的活性有非常顯著性提高(P<0.01),而在100mg/kg高劑量組時(shí),T-AOC活性有顯著性降低(P<0.05);對(duì)皮膚中羥脯氨酸含量的影響無(wú)差異顯著性意義(P>0.05)。
　?、恫煌瑵舛鹊狞\乳海參膠原蛋白多肽樣品對(duì)新西蘭兔左心室動(dòng)脈血體外活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)的影響結(jié)果表明,相對(duì)于對(duì)照組而言,海

9、參膠原多肽對(duì)體外凝血指標(biāo)(APTT、PT、TT)有雙重調(diào)節(jié)作用。PT在樣品濃度為100.0mg/ml、200.0mg/ml、400.0?g/ml時(shí),與對(duì)照組相比均有顯著性縮短(P<0.05);與對(duì)照組相比,TT在樣品濃度為100.0mg/ml、200.0mg/ml時(shí),有顯著性縮短(P<0.05);PT和TT在高濃度組800.0mg/ml時(shí),與對(duì)照組相比均延長(zhǎng),其中TT有顯著性的延長(zhǎng)(P>0.05);APTT在樣品濃度為50.0mg/ml

10、、100.0mg/ml、200.0mg/ml時(shí),與對(duì)照組相比均縮短,且有顯著性差異(P<0.05)。而在低濃度組12.5mg/ml、25.0mg/ml時(shí),相對(duì)于對(duì)照組而言,APTT時(shí)間均延長(zhǎng),且在12.5mg/ml時(shí)有顯著性延長(zhǎng)(P<0.05)。
　　本文首次對(duì)黑乳海參膠原蛋白多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了研究,采用多種現(xiàn)代層析分離技術(shù)制備純化了大分子膠原蛋白多肽,應(yīng)用 Edman降解和質(zhì)譜方法測(cè)定了多肽的氨基酸序列,并進(jìn)行了多種