重組FLAG標簽的融合表達純化及親和常數(shù)的測定.pdf

1、FLAG標簽是由八個氨基酸殘基DYKDDDDK組成的表位標記物(epitope)，序列簡短，對目標蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性影響小，可以用一條人工合成的寡聚核苷酸來編碼。FLAG標簽可以融合到目標蛋白的N端或者C端，或與其他親和標簽串聯(lián)使用。FLAG自身含有一個腸激酶切割位點DDDDK，可以通過腸激酶切割除去。現(xiàn)已發(fā)展出三種抗FLAG單克隆抗體M1、M2和M5，單抗M1特異性識別具有N-FLAG序列的融合蛋白，單抗M5的出現(xiàn)是為了應(yīng)用于具有N

2、-Met-FLAG序列的融合蛋白，顯示出對N端Met-FLAG具有更高的親和力，單抗M2可以識別以上幾種N端或C端FLAG融合蛋白，因而具有通用性。FLAG標簽已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的免疫印跡、免疫吸附純化、免疫共沉淀等領(lǐng)域。
　　 為了在多肽芯片上應(yīng)用FLAG標簽檢測蛋白質(zhì)的相互作用，以FLAG的原始序列DYKDDDDK為模板，設(shè)計了兩個新的序列DYKDYKYK和DYKGGGYK，通過兩次PCR反應(yīng)分別將以上三種FLAG標簽融合

3、到人SHP-2基因編碼的NSH2蛋白的C端，將His標簽融合到NSH2蛋白的N端并將其命名為His-NSH2-FLAG基因，該系列重組基因長348bp，編碼116個氨基酸，預(yù)測分子量為1.kDa。將PCR擴增得到的His-NSH2-FLAG基因亞克隆到表達載體pGEX-2t相應(yīng)的酶切位點上，得到重組表達質(zhì)粒pGEX-2t-His-NSH2-FLAG，PCR擴增、雙酶切及DNA測序鑒定表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(

4、DE3)感受態(tài)細胞并在LB培養(yǎng)基中表達重組蛋白，用終濃度為0 mM的IPTG在30℃誘導(dǎo)重組菌3h后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在4.kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符(GST融合標簽2.kDa，His-NSH2-FLAG1.kDa)，該系列重組蛋白以可溶性形式存在于菌體裂解液上清中。經(jīng)GST親和純化和FPLC分子篩層析進一步純化后，SDS-PAGE電泳分析表明純化所得重組蛋白純度高于90％。Wester.blot