人類胸苷酸合成酶的原核表達(dá)及活性測定.pdf

1、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS）能催化生物體內(nèi)的2'-脫氧尿苷-5'-磷酸（dUMP）甲基化形成2'-脫氧胸苷-5'-磷酸（dTMP），后者進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)代謝為脫氧胸苷三磷酸（dTTP），dTTP為DNA合成所必需的前體物質(zhì)。這一反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)dTMP的唯一來源，所以多年來TS一直是腫瘤化學(xué)治療的重要靶點(diǎn)。研究藥物對胸苷酸合成酶的抑制活性以及藥物與胸苷酸合成酶的作用機(jī)理，就需要大量的純酶作為前提，傳統(tǒng)生物提取

2、難以滿足要求。隨著基因技術(shù)的飛速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)胸苷酸合成酶的體外表達(dá)，成為突破此瓶頸的有效手段。
　　 本課題在人TS cDNA不發(fā)生定點(diǎn)突變的情況下，以攜帶野生型人TS cDNA的質(zhì)粒TS-pcDNA3.1-zeo（+）為模板，通過PCR和TA克隆技術(shù)擴(kuò)增目的基因，并將其與表達(dá)載體pET28b（+）連接得到重組表達(dá)載體TS-pET28b（+），通過CaCl2轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒TS-pET28b（+）轉(zhuǎn)入到大腸桿菌R

3、osetta（DE3），然后在Kan抗性的選擇培養(yǎng)基篩選出克隆子，利用PCR、雙酶切對克隆子進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子TS-pET28b（+）/Rosetta（DE3）；重組大腸桿菌在發(fā)酵過程中加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE及Western-Blotting鑒別表明表達(dá)產(chǎn)物為含有6×His-tag融合標(biāo)簽的重組人類胸苷酸合成酶；通過L9（33）正交試驗(yàn)確定TS-pET28b（+）/Rosetta（DE3）的最佳誘

4、導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度37℃，IPTG濃度1.5mM，誘導(dǎo)時間8小時，在最優(yōu)化條件下重組人胸苷酸合成酶約占菌體總蛋白的43.5％，表達(dá)形式主要以包涵體存在。
　　 為了獲得高純度的、具有天然活性的人TS蛋白，本實(shí)驗(yàn)利用重組人類TS蛋白中的6×His-tag融合標(biāo)簽，通過固定金屬離子親和層析Ni-NTA進(jìn)行特異性純化，獲得了純度為90％以上的TS蛋白；以純化得到的重組人TS純化液為原料，利用氧化-還原轉(zhuǎn)化透析系統(tǒng)對其進(jìn)行體外復(fù)性，復(fù)性