環(huán)二核苷酸合成酶基因丙酸誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、環(huán)二核苷酸(Cyclic di-nucleotides)是目前發(fā)現(xiàn)的重要的第二信使分子。研究表明它們能傳遞多種細(xì)胞外的不同信息，調(diào)節(jié)大量不同的生理生化過程，如細(xì)菌的生物膜形成和宿主天然免疫應(yīng)答，可用于免疫治療、免疫預(yù)防或疫苗佐劑用于人和動物的臨床研究。鑒于環(huán)二核苷酸的重要功能及其應(yīng)用價值，本試驗對10種環(huán)二核苷酸合成酶基因進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建及體外誘導(dǎo)表達(dá)，以期為c-GAMP及c-di-GMP體外合成及疫苗佐劑研究奠定基礎(chǔ)。
　　

2、首先，本試驗通過對10個不同物種來源的環(huán)二核苷酸合成酶基因及丙酸誘導(dǎo)型載體的多克隆位點的核苷酸序列進(jìn)行分析，設(shè)計BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶位點用于10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶丙酸誘導(dǎo)型載體構(gòu)建;PCR擴增和酶切獲取10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶基因的線性片段后，用T4連接酶將10個基因與相同雙酶切處理的載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3);利用雙酶切及測序的方法鑒定重組質(zhì)粒;構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)丙酸鈉誘導(dǎo)表達(dá)后，

3、SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白的表達(dá);對有重組蛋白表達(dá)的菌體超聲破碎，取上清樣品進(jìn)行Western blot分析鑒定重組蛋白是否為可溶性表達(dá)。試驗結(jié)果表明成功構(gòu)建了10個不同物種的環(huán)二核苷酸合成酶基因的丙酸誘導(dǎo)型原核表達(dá)重組質(zhì)粒，8個重組質(zhì)粒在BL21中有表達(dá)且為可溶性表達(dá)。
　　其次，利用Ni-NTA Agarose親和純化霍亂弧菌環(huán)二核苷酸合成酶VC0179重組蛋白并用TEV酶切獲取靶蛋白。體外酶促反應(yīng)檢測VC0179重組蛋