法夫酵母蝦青素合成酶基因的原核表達研究及其表達差異分析.pdf

1、集萎夫學碩士學位論文法夫酵母蝦青素合成酶基因的原核表達研究及其表達差異分析ProkaryoticexpressionofBcaroteneconvertingenzyme(Asy)geneandanalysisofitsdifferentialexpressionin尸：haffiarhodoz)rensionartiarnoaozyma_I，舶學科門類：堡堂論文答辯日期：2Q呈2生魚月蘭旦法夫酵母p胡蘿卜素轉化酶基因的原核表達研究及其

2、表達差異分析摘要蝦青素(astaxanthin)是一種抗氧化性能極強的天然類胡蘿卜素，具有著色、抗腫瘤、增強免疫力等多種生物學功能，被廣泛的利用于水產養(yǎng)殖、醫(yī)藥、保健食品等行業(yè)中。法夫酵母是一種重要的天然蝦青素資源，其體內的8一胡蘿卜素轉化酶(Asy)是目前發(fā)現唯一一個直接參與氧化B胡蘿卜素成為蝦青素的酶，但是關于該酶及編碼該酶的基因(asy)的研究相對較少。本文針對法夫酵母中的asy基因進行了以下的研究：1、采用eDNA末端快速擴增技

3、術，克隆得到法夫酵母(Phaffiarhodozyma)7812菌株的asy基因全長eDNA序列(AccessionNOHM2047081)，該序列總長1971bp，最大開放閱讀框為1614bp，可編碼538個氨基酸，與GenBank能檢索到的的唯一一條asy基因mRNA序列(AccessionNODQ0020071)一致性達到97％。2、將asy基因的eDNA克隆到pET32a載體后，轉化EcoliBL21(DE3)菌株進行表達。表達

4、的Asy融合蛋白分子量約為70kDa；優(yōu)化后，在26℃，05mmol／LIPTG的條件下誘導時，可溶性融合蛋白比例可提高至85％；進一步在EcoliBL21(DE3)中共表達攜帶asy基因的質粒和pACCARl6Acrtx質粒(攜帶由乙酰輔酶A合成B胡蘿卜素的基因鏈)，采用液相色譜分析共轉化菌株的類胡蘿卜素產物時發(fā)現，與對照相比，共轉化菌株的類胡蘿卜素產物的成分發(fā)生了明顯變化，其中0【胡蘿卜素的含量明顯減少，伴隨出現了三種新的色素，根據

5、出峰時間判斷其中一種為p胡蘿卜素和蝦青素的中間產物6隱黃質。3、初步分析四個具有不同發(fā)酵特征和產類胡蘿卜素特性的菌株中類胡蘿卜素、口一胡蘿卜素和蝦青素的合成量與asy基因表達量的關系發(fā)現：JMULY322和JMU15spw的產物中檢測不到蝦青素，但是這兩個菌株的asy基因均有表達；JMUMVPl4和JMUVDL668能合成蝦青素，48h時，前者的asy基因表達量高于后者，培養(yǎng)48h和120h時，JMU—MVPl4的總類胡蘿卜素、B胡蘿卜

6、素和蝦青索的產率都比JMU—VDL668高，由此可以看出，相對于JMUVDL668，JMUMVPl4的asy基因的高效表達可能是該菌高產蝦青素的原因之一。4、在搖瓶培養(yǎng)的不同時間添加B胡蘿卜素，JMUVDL668的總類胡蘿卜素產量總是維持在300—400gg／g的水平。當JMU—VDL668自身合成的總類胡蘿卜素含量接近或低于300gg／g時，可以吸收環(huán)境中的B一胡蘿卜素，這說明JMU—VDL668細胞內的總類胡蘿卜素含量可能存在一個閾