基于基因組重排技術的紅法夫酵母蝦青素高產株選育.pdf

1、蝦青素是一種高附加值的酮式類胡蘿卜素，具有極強的淬滅單線態(tài)氧和清除氧自由基的能力，在食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖業(yè)等方面有廣闊的應用前景。用紅法夫酵母生產蝦青素，具有發(fā)酵周期短，易于實現高密度培養(yǎng)等特點而受到廣泛關注。本文用基因組重排技術對紅法夫酵母進行育種，篩選高產菌株。 以紅法夫酵母野生菌株As2.1557作為出發(fā)菌株，經過紫外線和亞硝基胍復合誘變，以75μmol/L的二苯胺作為篩選劑，最終選育出三株蝦青素高產菌株，其中蝦青素產量最高的

2、可達到1.188mg/L，較出發(fā)菌株提高了48％左右，且遺傳性狀穩(wěn)定。 對紅法夫酵母的原生質體制備、再生以及融合條件進行了研究。分別考察了菌體菌齡、酶濃度、酶解時間、酶解溫度等因素對紅法夫酵母原生質體制備和再生的影響，采用響應面法優(yōu)化紅法夫酵母原生質體制備和再生的酶解條件，在該最優(yōu)條件紅法夫酵母原生質體制備率和再生率之積可達到60％以上?？疾炝薖EG濃度、融合溫度、融合時間以及Ca2+濃度對紅法夫酵母原生質體融合的影響，確定了紅

3、法夫酵母原生質體融合的最適條件。并分別采用紫外線滅活法和熱滅活法滅活原生質體，進行滅活雙親原生質體融合實驗。 以復合誘變所得到的三株高產突變株以及實驗室保藏的另一株抗β-紫羅酮高產突變株作為親本株，進行基因組重排育種，第一輪通過抗性篩選融合子，第二輪中用雙親滅活原生質體融合，最終篩選得到一株高產菌株，其蝦青素產量為1.950mg/L，比出發(fā)菌株提高了1.43倍，且遺傳性狀穩(wěn)定。 運用代謝通量分析的方法，分析和對比了野生菌

4、株、基因組重排的親本株和重排之后得到的高產株的代謝通量分布情況。結果表明：重排菌株PP途徑的通量較親本株有所減小，但是EMP途徑和TCA循環(huán)的途徑的通量增大；用于生物質合成的通量也略有增加；重排菌株的丙酮酸脫氫酶的反應效率依然較低，約有32％的丙酮酸分泌到胞外。相關酶活實驗表明，重排菌株的丙酮酸脫氫酶的活性提高有限，而與蝦青素的前體物乙酰輔酶A的生成有密切關系的檸檬酸裂解酶的活性則有顯著的增加，這一結果也從一定程度上闡明了重排菌株提高產