基于基因組重排的多殺菌素高產(chǎn)菌株選育及儲糧新制劑的研究.pdf

1、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵可產(chǎn)生胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物-多殺菌素。多殺菌素兼有生物農(nóng)藥的安全性和化學合成農(nóng)藥的速效性以及對哺乳動物、魚類、鳥類和大多數(shù)益蟲具有極高的安全界限等優(yōu)點,因此開發(fā)該產(chǎn)品具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益。本文利用課題組前期通過不同物理化學誘變和分子生物學方法獲得的八株高產(chǎn)多殺菌素的刺糖多孢菌為出發(fā)菌株,通過3輪基因組重排獲得多殺菌素高產(chǎn)菌株。在此基礎上,利用大孔樹脂吸附結(jié)合硅

2、膠柱層析技術(shù)對發(fā)酵液中多殺菌素的分離純化進行研究。最后以多殺菌素為原藥,制備出符合糧庫要求的儲糧防護新制劑。主要研究結(jié)果如下:
　　1、以8株刺糖多孢菌為出發(fā)菌株,采用96孔板發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)合生物檢測的高通量篩選方法,探索了原生質(zhì)體制備、再生、雙親滅活和原生質(zhì)體融合等條件,并通過3輪基因組重排獲得了多殺菌素高產(chǎn)菌株。結(jié)果表明:當菌齡為65 h、溶菌酶濃度為4.00 mg/mL,39℃處理時間20 min時,原生質(zhì)體的制備率及再生率分別

3、為92.30％和7.66%;60℃恒溫水浴90 min以上和紫外照射200 s以上為雙親滅活條件;PEG濃度為50%,在32℃下處理15 min時,原生質(zhì)體融合率約為1.18%。最終獲得1株產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了36.07%且遺傳穩(wěn)定的融合株。
　　2、利用大孔樹脂吸附結(jié)合硅膠柱層析技術(shù)對發(fā)酵液中多殺菌素的分離純化進行了研究?？疾炝颂崛∪軇?、發(fā)酵液pH和料液比對浸提多殺菌素的影響;并對7種不同極性的大孔吸附樹脂進行了靜態(tài)和動態(tài)吸附性

4、能的研究,考察了不同吸附、解吸條件對大孔吸附樹脂性能的影響,最后對硅膠柱層析法精制多殺菌素的工藝條件進行了探索。結(jié)果表明:當發(fā)酵液pH為8.0,料液比1:3(g:v)時,乙醇可高效浸提多殺菌素;大孔吸附樹脂 DM11對多殺菌素的靜態(tài)吸附量和解吸率分別為12508.00μg/g(濕樹脂)和93.47%;大孔樹脂動態(tài)吸附最佳pH為9.0,最佳載樣比是多殺菌素質(zhì)量(mg):樹脂體積(mL)為2.5:1;采用70.00~95.00%乙醇梯度洗脫

5、,多殺菌素洗脫率為97.50%;多殺菌素精制時硅膠柱以石油醚/乙酸乙酯/甲醇(2:1:0.2(v/v/v)和1:1:0.25(v/v/v))為洗脫劑進行分段洗脫。該工藝得到的多殺菌素回收率為67.25%,純度為90.58%。
　　3、以多殺菌素為原藥,通過檢測微乳劑熱貯、冷貯、常溫穩(wěn)定性和分散性以及原料成本等指標對多殺菌素微乳劑的配方進行篩選。結(jié)果表明:以3.00%二甲苯為助溶劑,7.00%聚氧乙烯脂肪酸酯與聚甘油脂肪酸酯為乳化劑