彌拜菌素高產(chǎn)菌株的選育.pdf

1、彌拜菌素是一種高效殺蟲劑(一種米爾貝霉素A3、A4的混合物，其A3:A4的比例為30:70)，對大多數(shù)農(nóng)業(yè)害蟲、寄生蟲具有廣譜防治活性，具有良好的應(yīng)用價值。本論文通過推理選育的方法迅速提高彌拜菌素產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力，然后對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，測定發(fā)酵過程中的在線參數(shù)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的工藝參數(shù)。 首先通過對彌拜菌素產(chǎn)生菌H-101-4的復(fù)壯，獲得了一株產(chǎn)量較高，遺傳性狀穩(wěn)定的菌株H-103-8，產(chǎn)量比出發(fā)菌株H-101-

2、4提高了4％。以H-103-8為參試菌，比較了紫外線，亞硝基胍，甲基磺酸乙酯和紫外線，亞硝基胍復(fù)合誘變的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從致死率看，對菌株H-103-8的致死率甲基磺酸乙酯＞亞硝基胍＞紫外線；從誘變的正變率看，誘變效果紫外線＞亞硝基胍＞甲基磺酸乙酯；從效價的提高幅度看，經(jīng)過紫外誘變后，效價比原來提高了4.8％，經(jīng)亞硝基胍誘變后效價提高了7.8％，甲基磺酸乙酯誘變后效價提高了5.6％，復(fù)合誘變效果又優(yōu)于單一誘變劑的誘變，效價提高了8.4％

3、。通過對不同誘變劑誘變效果的比較，選用正變率高、產(chǎn)量提高幅度大的誘變劑，大大提高了篩選的效率。 為減少選育過程中的工作量，我們采用了推理選育的方法。以H-103-8為出發(fā)菌株，采用亞硝基胍進(jìn)行誘變處理后，進(jìn)行了前體結(jié)構(gòu)類似物：乙酸鈉、氨基丙酮酸、丙酸鈉的耐性篩選，最終獲得了彌拜菌素產(chǎn)量達(dá)854μg/mL的菌株H-107-34，比出發(fā)菌株H-103-8提高了37％。以H-107-34為出發(fā)菌株，繼續(xù)采用NTG作為誘變劑進(jìn)行誘變處理

4、，結(jié)合鏈霉素抗性篩選獲得菌株H-108-29，最高產(chǎn)量達(dá)到946μg/mL，比出發(fā)菌株提高了10.7％。以純化后的菌株H-109-2為出發(fā)菌株，經(jīng)過EMS誘變處理后，結(jié)合2-去氧葡萄糖耐性篩選，獲得了菌株H-110-48，產(chǎn)量達(dá)到994μg/mL，比出發(fā)菌株提高了4.4％。經(jīng)紫外線、亞硝基胍復(fù)合誘變后，結(jié)合彌拜菌素的結(jié)構(gòu)類似物米爾貝肟耐性篩選，獲得了最高效價達(dá)1124μg/mL的菌株H-111-35，比出發(fā)菌株提高了13％。 此

5、外，在搖瓶水平進(jìn)行了彌拜菌素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究，探索了不同碳源、氮源、無機鹽、微量元素和前體等對彌拜菌素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：碳源以蔗糖和可溶性淀粉的混合碳源為最佳；氮源以棉籽餅粉、脫脂奶粉的混合氮源最佳；無機鹽K2HPO4、MgSO4、CaCO3在低濃度時對抗生素的合成均有一定的促進(jìn)作用，同時研究了微量元素和前體對產(chǎn)量的影響。最終在最佳碳、氮源的基礎(chǔ)上，通過正交分析確定了一套發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方(g/L)：可溶性淀粉20，蔗糖120

6、，脫脂奶粉15，棉籽餅粉15，酵母粉5，F(xiàn)eSO40.1，K2HPO41，MgSO4·7H2O0.5，CuSO4·5H2O0.05，ZnSO4·7H2O0.01，Na2MoO40.05，CaCO33。 另外，對彌拜菌素發(fā)酵條件進(jìn)行了考察，即發(fā)酵溫度、通氣量、剪切力、種齡和移種量等。發(fā)現(xiàn)250mL三角瓶中裝量為25mL，pH為7.2，接種量為6％時，在溫度28℃條件下發(fā)酵12天，彌拜菌素發(fā)酵產(chǎn)量最高。采用新的發(fā)酵工藝后，高產(chǎn)菌株H