紅法夫酵母酶法破壁提取蝦青素及其β-環(huán)糊精包合的研究.pdf

1、紅法夫酵母堅韌的細(xì)胞壁嚴(yán)重阻礙了其細(xì)胞內(nèi)蝦青素的提取及應(yīng)用，因此建立合適的細(xì)胞破壁方法以提高蝦青素的生物利用度及提取率是一個急需解決的關(guān)鍵問題。本論文研究了環(huán)狀芽孢桿菌胞壁溶解酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其用于紅法夫酵母破壁提取蝦青素，以及紅法夫酵母蝦青素的穩(wěn)定性及其β-環(huán)糊精包合保護(hù)方法，主要實驗結(jié)果如下：　　對環(huán)狀芽孢桿菌B.circulansA1.383進(jìn)行紫外線誘變處理，經(jīng)過初篩、搖瓶復(fù)篩以及傳代穩(wěn)定性實驗，獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)胞壁溶解酶的突變

2、株A1.383-2，其胞壁溶解酶產(chǎn)量比親株提高了116.9％。通過對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化實驗，得出其生產(chǎn)胞壁溶解酶的適宜條件：碳源采用酵母葡聚糖，濃度為10g/L；氮源為蛋白胨與(NH4)2SO4混合，使其總濃度為4g/L；接種量6％～10％(v/v)；搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝液40mL；發(fā)酵溫度為30℃～35℃；培養(yǎng)基初始pH6.5～7.0。在上述條件下發(fā)酵54h后可獲得最高酶活74.6u/mL，比優(yōu)化前酶活提高了38.7％。

3、　　通過單因素及均勻?qū)嶒炘O(shè)計，確定了將B.circulansA1.383-2胞壁溶解酶用于紅法夫酵母破壁提取蝦青素的最佳酶作用條件，即當(dāng)pH值為5.0，加酶量為1614.5u/g干酵母，37℃溫和震蕩反應(yīng)16.5h，蝦青素的提取率可達(dá)到98％以上；此胞壁溶解酶穩(wěn)定的pH值范圍為4.8～9.8，在50℃以下表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性；對此胞壁溶解酶中多種酶活進(jìn)行了測定，確定該復(fù)合酶含有β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶

4、以及木聚糖酶活性?！　?-脫氧-D-葡萄糖的存在會影響葡萄糖的正常代謝以及酵母細(xì)胞壁的合成，但實驗表明，紅法夫酵母培養(yǎng)中添加0.005g/L-0.02g/L的2-脫氧-D-葡萄糖卻可促進(jìn)蝦青素積累，而且生物量基本保持不變，在增加蝦青素產(chǎn)量的同時還能縮短酶法破壁的時間。當(dāng)2-脫氧-D-葡萄糖添加濃度為0.02g/L，且在紅法夫酵母培養(yǎng)的前36h添加時，蝦青素含量可提高到對照組的113.7％，采用胞壁溶解酶對紅法夫酵母破壁提取蝦青素，作用

5、12h提取率可達(dá)94.7％。推測2-脫氧-D-葡萄糖促進(jìn)蝦青素合成的機理是由于其在細(xì)胞內(nèi)抑制了電子傳遞鏈的某個酶，從而阻斷呼吸鏈，造成氧自由基的大量積累，促使蝦青素的合成。　　通過對紅法夫酵母與環(huán)狀芽孢桿菌兩階段混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化，總結(jié)出紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素及酶法破壁提取的適宜工藝為：培養(yǎng)基初始糖濃度為30g/L，環(huán)狀芽孢桿菌的最佳接種時間為紅法夫酵母培養(yǎng)60h～72h，接種量為10mL/L(1010個細(xì)胞/mL)，接種后最適培養(yǎng)溫度為

6、30℃，pH為6.5，總發(fā)酵時間為120h，在此條件下，紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量可達(dá)到8960.2ug/L，蝦青素最終提取率可達(dá)到96.8％。在兩階段混合培養(yǎng)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計了紅法夫酵母與環(huán)狀芽孢桿菌三階段混合培養(yǎng)方案，發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加0.02g/L的2-脫氧-D-葡萄糖，三階段混合培養(yǎng)明顯優(yōu)于兩階段混合培養(yǎng)，不僅最終的蝦青素產(chǎn)量提高到9563.4ug/L，發(fā)酵時間也縮短為108h，提取率提高到97.4％，最終可提取出的

7、蝦青素總量為9314.8ug/L?！　∥r青素對短時受熱有較好的穩(wěn)定性，對光卻非常敏感，但無論是在加熱還是在光照條件下，酶法破壁提取的蝦青素比酸法及珠磨法破壁提取的更為穩(wěn)定；當(dāng)暴露在空氣中時，氧成為蝦青素褪色的另一個主要因素；有機溶劑中極性最小的石油醚有利于蝦青素的保存，而極性最大的丙酮則十分不利于色素的保存，色拉油能很好的保護(hù)色素，因其較好地隔離了空氣中的氧，起到了一定的屏蔽作用。所以，應(yīng)采用避光、密閉、充氮或真空、低溫貯存的方法來延

8、緩紅法夫酵母蝦青素的褪色。　　皂化能提高蝦青素-β-環(huán)糊精包合的包合率；通過正交試驗對包合物制備條件進(jìn)行優(yōu)化，可知在本實驗范圍內(nèi)，影響包合率各因素的主次為：D(轉(zhuǎn)速)＞C(時間)＞B(溫度)＞A(環(huán)糊精用量)，其中轉(zhuǎn)速為顯著影響因素；通過對攪拌時間及溫度進(jìn)行擴展試驗，確定了最佳包合條件為：β-環(huán)糊精加入量為7g/50mg蝦青素，溫度40℃，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，攪拌時間5h，在此條件下制備蝦青素-β-環(huán)糊精包合物，其包合率高達(dá)87