雨生紅球藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化及蝦青素的提取.pdf

1、蝦青素具有很強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力，可有效防止組織、細(xì)胞和DNA的氧化損傷，具有廣泛的應(yīng)用。雨生紅球藻是目前公認(rèn)的蝦青素的最好生物來(lái)源。雨生紅球藻具有明顯的生命周期，通過(guò)環(huán)境脅迫藻細(xì)胞由綠色游動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為厚壁孢子并大量積累蝦青素。本文以實(shí)驗(yàn)室保藏的一株雨生紅球藻為藻種，以蝦青素含量為指標(biāo)，首先通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)，對(duì)轉(zhuǎn)化階段的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，然后將優(yōu)化后的乙酸鈉培養(yǎng)基中的蝦青素含量與葡萄糖培養(yǎng)基中蝦青素含量進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)添

2、加葡萄糖的培養(yǎng)基蝦青素含量更高，因此選擇葡萄糖培養(yǎng)基作為最優(yōu)培養(yǎng)基，成分為：葡萄糖：3g/L，KNO3:0.3 g/L，KH2PO4：0.03 g/L，MgSO4:0.1 g/L，CaCl2:0.08 g/L，F(xiàn)e-EDTA：100μl/L，微量元素：100μl/L，蝦青素含量為16.975±0.6825mg/L，比乙酸鈉最優(yōu)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的蝦青素含量高53.67％。而后，通過(guò)Box-Behnken對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：

3、轉(zhuǎn)化溫度29.92℃，轉(zhuǎn)化光照7203.951x，轉(zhuǎn)化時(shí)間10.6 d，pH10，蝦青素含量達(dá)33.7964±1.5561 mg·L-1，是未優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件時(shí)的1.99倍。最后，對(duì)裝液量和轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)蝦青素含量的交互影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)：減少裝液量，增大藻液的相對(duì)表面積，可有效提高轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高蝦青素含量。在裝液量49.4911 ml，轉(zhuǎn)化時(shí)間為10.3577 d時(shí)，蝦青素含量達(dá)36.9138 mg/L，比100 ml裝液量情

4、況下轉(zhuǎn)化得到的蝦青素含量高10％左右。
　　 完成上述實(shí)驗(yàn)后，針對(duì)紅光對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響和藍(lán)光對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)：生長(zhǎng)最適光照為：白光為主，紅光為輔，白光：紅光(2：1)25001x，所得藻干重為0.7228±0.0301 g/L，比白光照射情況下高6.3％。最適轉(zhuǎn)化光照為：藍(lán)光(20001x)+白光(6000-70001x)，蝦青素含量達(dá)38.442±1.6418mg/L，比白光轉(zhuǎn)化情況下高14.9％左右，

5、且加入藍(lán)光后，藻細(xì)胞變紅的時(shí)間明顯縮短，轉(zhuǎn)化9d即可得最高蝦青素含量，比白光照射情況下約提前1.6 d，可見(jiàn)藍(lán)光對(duì)蝦青素積累的促進(jìn)作用較強(qiáng)，應(yīng)用于生產(chǎn)上可有效節(jié)約成本。若進(jìn)一步提高藍(lán)光比例可能會(huì)有更好的效果。
　　 為了找到合適的保種方法，對(duì)繼代保藏、固定化保藏和低溫保藏三種常見(jiàn)的藻種保藏方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低濃度(5％)液體保藏簡(jiǎn)便易行效果較好，保藏4個(gè)月后存活率和相對(duì)生長(zhǎng)速率常數(shù)分別為93.84±3.883％和0.4648±

6、0.0021d-1，適宜在科研實(shí)踐中使用；固定化保藏儲(chǔ)存方便，保藏4個(gè)月后存活率和相對(duì)生長(zhǎng)速率常數(shù)分別為：30.51±1.3285％和0.2641±0.0115d-1，此方法隨保藏時(shí)間延長(zhǎng)藻細(xì)胞死亡速率減慢，適合長(zhǎng)期保藏；10％DMSO做保護(hù)劑，-20℃低溫保藏時(shí)，存活率和相對(duì)生長(zhǎng)速率常數(shù)分別為42.27±1.8759％和0.155±0.0063d-1，20％DMSO做保護(hù)劑-40℃保藏時(shí)存活率和相對(duì)生長(zhǎng)速率常數(shù)分別為49.05±2.0

7、343％和0.175±0.0065 d-1，此種方法不易染菌、藻細(xì)胞性狀穩(wěn)定。
　　 通過(guò)對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取的初步研究，得到最佳破壁條件為：高速分散均質(zhì)機(jī)頻率50 Hz，23000 rpm，破壁6 min其破壁率達(dá)96±3.9351％左右，破壁率高，處理量較大，適用于生產(chǎn)。對(duì)用于蝦青素提取的有機(jī)溶劑進(jìn)行了篩選，得出DMSO和丙酮(4:1)混合時(shí)蝦青素提取率最高，可達(dá)34.0408±1.5337 mg/L，比DMSO提取時(shí)高