犬貓結核病分子檢測技術的建立及防治方法的初步探索.pdf

1、揚州大學碩士學位論文犬貓結核病分子檢測技術的建立及防治方法的初步探索姓名：王偉申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：丁鏟秦愛建20090501II揚州大學碩士學位論文從上海市不同區(qū)縣采集352份犬貓鼻液、痰液、尿液及寵物飼料樣品進行檢測，以16srRNA、IS6110、Rv3878、ISl081、ESAT6和CFP10等為目的基因設計引物，結果顯示：非健康犬貓樣品DNA中，ESAT6和CFP10基因檢出率分別為43％和386％，對

2、應的16srI斟A基因符合率僅為7％～8％，而致病性分枝桿菌特異的引物：TB274、IS6110和ISl081基因不能被檢出；而在健康犬貓樣品DNA中，所有基因的檢出率均很低。本研究結果表明，健康犬貓可能攜帶有大量非典型分枝桿菌，而且罹病犬貓被非典型分枝桿菌感染的幾率較健康犬貓更大。3CFP10／ESA工6融合蛋白誘導IFN吖產生的初步研究以牛分枝桿菌強毒株DNA為模板，擴增獲得CFP10和ESAB6基因，利用疏水性氨基酸(Gly4Se

3、r)3為Linker，將兩個蛋白融合表達于pET32a()載體中，并再ESAT6的C端連接HIVTat的蛋白轉導域，得到的兩種融合蛋白表達載體分別命名為：pCEl06、pCET。將上述載體轉化BL21(DE3)菌，經IPTG誘導，獲得CET和CEl06可溶性融合蛋白，將其分別免疫小鼠制備多抗，經重組桿狀病毒檢測為免疫熒光陽性反應。將上述抗原免疫Km系小鼠，4免后，取脾臟，分離淋巴細胞，利用CFP10(118齟)、ESAB6(116姐)多

4、肽為刺激物，采用ELISPOT法檢測IFN吖分泌水平。結果顯示：上述融合蛋白并可誘導低劑量的IFN吖產生，但差異并不顯著。4結核桿菌泛酸激酶的原核表達及純化泛酸激酶(CoaA)是泛酸(CoA)合成的關鍵性調節(jié)酶，可以用擬膽堿藥物通過競爭性抑制泛酸激酶的活性從而達到抑菌目的。本試驗克隆表達了牛分枝桿菌和鳥分枝桿菌的泛酸激酶基因(co以)，將其連接到pET32a()載體中進行原核表達。結果顯示：鳥分枝桿菌泛酸激酶呈現(xiàn)可溶性表達，而牛型分枝桿