對蝦白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)入胞途徑及其分子調控機制研究.pdf

1、白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是對蝦的主要病原，該病毒致死率高、傳染性強、宿主范圍廣，是水生甲殼類動物中最為嚴重的病毒性病原之一。因此，加深對WSSV感染致病機理的理解，尋找高效抗病毒防治方法，意義重大。培養(yǎng)細胞是病毒感染研究的有力工具，在甲殼動物原代細胞培養(yǎng)研究中，螯蝦造血組織干細胞(Haematopoietic tissue stem cell，Hpt cell)—Hpt細胞培養(yǎng)較為穩(wěn)

2、定，是WSSV感染研究的首選。本研究以紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)為研究對象，參照SOderh(a)ll等的研究方法培養(yǎng)紅螯螯蝦Hpt細胞，分析WSSV在Hpt細胞中的感染特性，篩選Hpt細胞感染W(wǎng)SSV后的差異表達基因，從分子生物學和細胞生物學角度探討WSSV入胞及其分子調控機制以及宿主細胞抵御WSSV感染機制。
　　利用分子生物學技術檢測WSSV基因表達，結合共聚焦顯微鏡分析WSSV感染Hpt細胞的過

3、程，結果顯示W(wǎng)SSV可在15 min內粘附或進入Hpt細胞，其中可能涉及病毒囊膜與細胞膜融合入胞過程;感染后1h和3h，IE1和VP28分別開始轉錄表達，表達量持續(xù)升高至96 hpi。此外，單病毒粒子成像研究揭示W(wǎng)SSV感染細胞僅占總Hpt細胞的10-15％，提示W(wǎng)SSV對不同類型Hpt細胞可能具有不同嗜性。
　　為探究WSSV感染Hpt細胞分子機制，我們采用抑制性消減雜交技術(Suppression subtractive hy

4、bridization，SSH)分析紅螯螯蝦Hpt細胞感染W(wǎng)SSV后不同時間(感染極早期1 hpi和感染晚期12 hpi)的基因差異表達。經(jīng)點雜交篩選、序列測定及生物信息學分析共篩選獲得了366個病毒感染相關差異表達基因，其中包括網(wǎng)格蛋白輕鏈基因(Cq-CLC)和伽馬氨基丁酸受體相關蛋白(Cq-GABARAP)，為深入研究內吞和自噬等相關活動在WSSV入侵宿主細胞中的作用奠定基礎。
　　細胞內吞作用是多數(shù)病毒侵入宿主細胞的主要途徑

5、。為研究WSSV入侵Hpt細胞的途徑，我們利用透射電鏡觀察WSSV入胞過程，結果顯示W(wǎng)SSV可以利用網(wǎng)格蛋白介導的內吞(Clathrin-mediated endocytosis，CME)和巨胞飲入侵Hpt細胞;進一步研究發(fā)現(xiàn)，利用CPZ和dynasore抑制CME可以明顯抑制WSSV的入胞和復制，利用EIPA和rottlerin抑制巨胞飲、利用MβCD和filipin抑制膜穴樣凹陷介導的內吞也起到了類似作用，說明WSSV可以利用上述三

6、種內吞方式進入宿主細胞。進一步利用RNAi技術抑制Cq-CLC和Cq-AP50等參與CME過程的關鍵因子，揭示CME是WSSV入侵宿主細胞的關鍵途徑。
　　克隆獲得Cq-GABARAP的cDNA序列，進一步探討其介導的WSSV入胞機制。RNAi或添加重組表達Cq-GABARAP蛋白后病毒感染試驗表明Cq-GABARAP可以促進WSSV入胞，CPZ阻斷CME下游通路能夠抑制Cq-GABARAP的促進作用，表明Cq-GABARAP可能

7、通過調節(jié)CME上游信號通路以促進WSSV入胞;此外，蛋白互作試驗發(fā)現(xiàn)，Cq-GABARAP可與包括VP28在內的多個WSSV囊膜蛋白結合，提示Cq-GABARAP與病毒粒子直接結合可能是其促進WSSV入胞的另一機制;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒感染早期WSSV可與自噬小體共定位，自噬調節(jié)制劑改變了Hpt細胞自噬活性、進而影響了WSSV入侵Hpt細胞，表明自噬可能參與內吞活動從而調節(jié)WSSV入胞。
　　此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Cq-GABARAP具

8、有抗WSSV功能?；虮磉_差異分析顯示Hpt細胞中Cq-GABARAP在感染W(wǎng)SSV后表達上調，RNAi或重組表達蛋白孵育后感染病毒試驗揭示Cq-GABARAP是一個抗WSSV因子，免疫印跡和電鏡觀察試驗揭示Cq-GABARAP可促進Hpt細胞攝入WSSV，并匯聚入胞病毒粒子成團，抑制病毒粒子入核啟動復制，從而發(fā)揮抗WSSV作用;雷帕霉素誘導自噬活性增強后，Hpt細胞內WSSV復制受到抑制，說明自噬可能是一種重要的抗WSSV防御反應。<