對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的構(gòu)建與VP28卵黃抗體的制備及其抗病性研究.pdf

1、對蝦白斑綜合征(WSS)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害性最大的病害之一，至今己席卷了世界各國的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前尚無有效的防治手段。因此，如何預(yù)防和控制該病毒病一直是近年來研究的熱點(diǎn)。本研究在構(gòu)建WSSV重組VP28抗原蛋白枯草芽孢工程菌（B.subtilis-VP28）與卵黃抗體(VP28-IgY)的基礎(chǔ)上，經(jīng)口服途徑免疫克氏原螯蝦，進(jìn)行保護(hù)螯蝦抵抗WSSV感染的效果試驗(yàn)，并初步研究B.subtilis-VP28和

2、VP28-IgY的抗病機(jī)理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.新型穿梭分泌性表達(dá)載體pBES的構(gòu)建
　　 在多功能穿梭克隆載體pBEC（來源于B.subtilis pUB110和Ecoli pGEM3載體）的基礎(chǔ)上，引入B.subtilis強(qiáng)啟動子Peo43和一段新天然信號肽序列，構(gòu)建了一新型B.subtilis-E,coli穿梭分泌性表達(dá)載體pBES。為評價所構(gòu)建載體的表達(dá)與分泌效率，引入β-葡聚糖酶報(bào)告基因，進(jìn)行分

3、泌量動態(tài)分析。經(jīng)SDS-PAGE分析及不同時間酶活測定表明，β-葡聚糖酶報(bào)告基因成功獲得分泌表達(dá)，在強(qiáng)啟動子pEo43作用下，其單位發(fā)酵液總酶活最高可達(dá)283.45U/ml。然而，胞外酶活最高為116.95U/ml，分泌比例為41.26％，可見此天然信號肽分泌能力有限，還需作進(jìn)一步的突變篩選。
　　 2.B.subtilis信號肽結(jié)構(gòu)區(qū)域氨基酸組成與分泌效率的關(guān)系
　　 從野生型天然信號肽N區(qū)正電荷數(shù)與H區(qū)疏水性改造的角

4、度出發(fā)，構(gòu)建了一系列(15個)信號肽突變體，研究信號肽結(jié)構(gòu)區(qū)域氨基酸組成與信號肽功能的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，N區(qū)的正電荷有利于提高信號肽分泌能力，但過高的電荷反而使分泌效率有所下降；H區(qū)疏水性對分泌效率影響較大，過高或過低的疏水性都不利于分泌識別過程；同時具有N區(qū)高正電荷及H區(qū)高疏水性的信號肽，反而分泌效率低；在N區(qū)高正電荷的情況下，H區(qū)中度疏水性的信號肽分泌能力最強(qiáng)。本研究篩出了兩條具有高分泌能力的突變信號肽：H3N2(MRARKIAG

5、MATSGGVAQPSSAVA)、H3N23(MRRRKIAGMATSGGVAQPSSAVA)，報(bào)告基因胞外分泌量分別達(dá)到80.28％與80.66％，比親本天然信號肽均提高1.95倍。本試驗(yàn)成功篩選并構(gòu)建得到基于強(qiáng)啟動子pEo43與高分泌能力信號肽H3N2、H3N23的枯草芽孢桿菌高效分泌表達(dá)載體pBES-H3N2和pBES-H3N23。
　　 3.vp28基因的高效分泌表達(dá)及分泌動態(tài)分析
　　 利用構(gòu)建的B.subti

6、lis高效分泌表達(dá)載體pBES-H3N2和pBES-H3N23，以低蛋白酶活性的B.subtilis WB600作為宿主菌，構(gòu)建了重組VP28蛋白枯草芽孢工程菌B.subtilis(pBES(H3N2)-VP28)和B.subtilis(pBES(H3N23)-VP28)，vp28基因成功獲得胞外分泌表達(dá)。用兔抗anti-VP28 IgG檢測，具有免疫反應(yīng)性。對分泌效率進(jìn)行動態(tài)分析，結(jié)果顯示，兩株高效表達(dá)菌株均在22h時達(dá)到最大VP28

7、蛋白分泌量，分別為45.6 mg/L和47.4 mg/L，22 h之后分泌量略有下降，最后趨于穩(wěn)定。
　　 4.特異性VP28-IgY的制備與穩(wěn)定性研究
　　 將表達(dá)純化的WSSV重組VP28抗原蛋白免疫150日齡的海蘭白蛋雞，免疫三次，每隔2周免疫一次。對卵黃中特異性VP28-IgY的抗體效價及其變化規(guī)律進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在首免后第14天即可檢測到特異性抗體(P/N=2.555，1:400)；第56天抗體效價達(dá)到最高

8、(P/N=14.920，1:3200);至120天試驗(yàn)結(jié)束時，抗體效價仍維持在較高水平(P/N=9.265，1:1600)。用水稀釋法結(jié)合50％、33％飽和硫酸銨沉淀提純IgY的方法，可得到特異性IgY估測純度約為83.6％。SDS-PAGE分析提純的IgY，發(fā)現(xiàn)重、輕鏈分別約為60 kDa與25 kDa，估算其總分子量約為170kDa。對VP28-IgY穩(wěn)定性研究表明，其在溫度低于70℃、pH3.0～10.0范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；對胃

9、蛋白酶和滲透壓具有較強(qiáng)的耐受性。
　　 5.口服工程菌B.subtilis-VP28和VP28-IgY的螯蝦體內(nèi)保護(hù)效果
　　 制備芽孢期和營養(yǎng)期形式的工程菌B.subtilis-VP28，并研究口服工程菌的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，以芽孢形式免疫組rVP28-bs的螯蝦相對存活率均高于營養(yǎng)期形式組rVP28-bv，在免疫后第3、14、28天攻毒，前者相對存活率分別為65.4％、78.3％和59.7％，后者相對存活率分別為38

10、.2％、51.7％和36.8％。為研究口服VP28-IgY中和病毒產(chǎn)生的保護(hù)效果，以0.01％、0.05％和0.1％的添加量添加至蝦餌料，連續(xù)投喂20天后口服攻毒，相對存活率分別為48.3％、86.0％和88.3％。以上結(jié)果表明，工程菌B.subtilis-VP28的芽孢形式，具有較理想的口服免疫效果；而以中和作用為主的VP28-IgY，其保護(hù)效果較為理想的最低添加量為0.05％。
　　 6B.subtilis-VP28和VP2

11、8-IgY抗病性機(jī)理初步研究
　　 對B.subtilis-VP28保護(hù)機(jī)理初步研究表明，工程菌B.subtilis-VP28能特異性降低WSS的發(fā)病率，并同時激發(fā)螯蝦體內(nèi)非特異性免疫因子及提高抗氧化能力，從而增強(qiáng)蝦體對WSSV的抵抗性。根據(jù)光鏡、電鏡觀察結(jié)果推測，口服VP28-IgY（0.05％添加量）組，在攻毒后初期，螯蝦體內(nèi)大部分病毒被中和，另一小部分病毒侵入血細(xì)胞及其它組織細(xì)胞，但在未達(dá)到致死量或未使組織達(dá)到嚴(yán)重?fù)p傷時，