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文檔簡介
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom Virus,PRRSV)主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難、高死亡率,具有傳播快、流行范圍廣、高度傳染性等特點,特別是“高致病性豬藍(lán)耳病”幾乎蔓延全國各地,造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于本病同其他引起豬繁殖障礙的疾病表現(xiàn)出極為相似的臨床癥狀,并由于新流行毒株的基因發(fā)生了突變,毒力增強,特別是豬群出現(xiàn)了
2、PRRSV與其他病原如豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等的混合感染,表現(xiàn)為癥狀、病變的非典型化和復(fù)雜化,給豬群的臨床診斷和防疫帶來新的難度。為了有效控制PRRS,我國豬群大量使用PRRSV疫苗。由于PRRSV滅活疫苗在臨床使用的防疫效果不穩(wěn)定,目前多用PRRSV弱毒疫苗,而大部分豬群接種PRRSV弱毒疫苗以后,將出現(xiàn)一定時期的病毒血癥,豬體長期帶毒,甚至排毒,豬群一旦感染自然界的野毒,將很難進(jìn)行鑒別,不利于PRRSV的臨床診斷和控制。因此,有必要建
3、立一套能夠區(qū)分PRRSV自然感染與疫苗免疫的快速鑒別診斷技術(shù)。
RT-PCR方法是一種可以快速檢測血液、精液以及組織樣品中病毒核酸的生物技術(shù)。利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR還可以區(qū)分不同基因型的病毒株。PRRSV的ORF5基因和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)的Nsp2基因是基因組高度變異的區(qū)域,而且目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV基因缺失主要集Nsp2基因中,GP5和Nsp2蛋白的變異會導(dǎo)致病毒毒力和致病性的差異。本論文開展了兩方面的工作,
4、一是建立了常規(guī)RT-PCR方法,二是用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法檢測了2011~2014年的部分送檢樣品。結(jié)果如下:
1.常規(guī)RT-PCR方法的建立
本研究根據(jù)PRRSV基因編碼區(qū)中變異最大的GP5和非編碼區(qū)中變異最大的Nsp2兩個目的片段,設(shè)計了2對GP5引物(P1和P2)和5對Nsp2引物(N1和N5),克隆了GP5和Nsp2基因,從中各篩選優(yōu)化出一套效果最好的引物(P2和N3)構(gòu)建了兩套常規(guī)RT-PCR,并
5、進(jìn)行了特異性和靈敏度實驗。結(jié)果表明,本文建立的常規(guī)RT-PCR僅能擴增出PRRSV毒株,不擴增豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬流感病毒等毒株。擴增GP5雙鏈DNA的靈敏度為700拷貝,擴增GP5基因組的靈敏度為稀釋106倍;擴增Nsp2雙鏈DNA的靈敏度為80拷貝,擴增Nsp2基因組的靈敏度為稀釋107倍。結(jié)果表明,本文建立的常規(guī)RT-PCR具有良好的特異性和較高的靈敏度,可用于臨床
6、檢測。
2.常規(guī)RT-PCR方法的臨床應(yīng)用
采用本文建立的常規(guī)RT-PCR方法,對2011~2014年送檢的329批血樣、組織病料等進(jìn)行了檢測。首先,對檢測陽性樣品測序后建立了PRRSV序列庫,用DNAstar同源性分析軟件對P2引物擴增得到的全部序列及送檢單位使用的疫苗序列進(jìn)行對比分析,并對4家豬場近4年的陽性序列分別進(jìn)行同源性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用本文所構(gòu)建的常規(guī)RT-PCR方法能明顯區(qū)分野毒株與疫苗株;而且用N3引物
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