細(xì)胞自噬及其microRNAs調(diào)控分子的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、背景與目的
　　自噬是細(xì)胞成份的自我降解過(guò)程，它是存在于真核細(xì)胞中一種普遍的生命現(xiàn)象。自噬可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。microRNAs是一類(lèi)由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯成蛋白質(zhì)的小調(diào)控RNA。它通過(guò)與靶mRNA的序列互補(bǔ)，以降解靶mRNA或抑制其翻譯。近來(lái)研究表明microRNAs參與生物體的一系列生物過(guò)程，而且 microRNAs在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、感染、衰老、心臟病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程

2、中起著重要的作用。最近已有報(bào)道，microRNAs可以調(diào)控自噬過(guò)程中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。本研究通過(guò)系列生物信息學(xué)方法，篩選對(duì)自噬過(guò)程有潛在調(diào)控作用的microRNAs，并通過(guò)相關(guān)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)利用回轉(zhuǎn)器模擬微重力效應(yīng)，探究神經(jīng)細(xì)胞自噬與微重力之間的關(guān)聯(lián)性。
　　方法
　　利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出可能參與自噬調(diào)控的microRNAs。利用雷帕霉素分別誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF7、卵巢癌細(xì)胞SKOV-312h以使細(xì)胞產(chǎn)生自噬

3、。microRNAs模擬物或microRNAs抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，此時(shí)microRNAs過(guò)表達(dá)或低表達(dá)，然后觀察細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的表達(dá)水平?；剞D(zhuǎn)模擬微重力的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，回轉(zhuǎn)條件下培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y12h、24h，相同條件下靜止培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。Western Blotting方法檢測(cè) LC3蛋白表達(dá)水平。熒光顯微鏡觀察綠色熒光標(biāo)記的LC3（GFP-LC3）點(diǎn)狀聚集物變化。
　　結(jié)果
　　

4、（1）建立自噬誘導(dǎo)的模型：雷帕霉素處理細(xì)胞12h以誘導(dǎo)自噬，雷帕霉素組中GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物多于對(duì)照組分別體現(xiàn)在MCF7細(xì)胞（P<0.05）和SKOV-3細(xì)胞（P<0.001）中。MCF7細(xì)胞中雷帕霉素+氯化銨組GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物顯然高于其余各組（P<0.01）。Western Blotting檢測(cè)MCF7細(xì)胞和SKOV-3細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，雷帕霉素組皆顯示 LC-II表達(dá)升高。MCF7細(xì)胞中雷帕霉素+氯

5、化銨組 LC3-II表達(dá)增多更為顯著。
　?。?）篩選出與自噬相關(guān)的microRNAs為miR-142-5p，經(jīng)生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-142-5p對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞自噬中LC3表達(dá)無(wú)明顯影響；
　?。?）篩選與卵巢癌細(xì)胞自噬有關(guān)的4個(gè)microRNAs中，其中一個(gè)microRNA在雷帕霉素誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞情況下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNAs模擬物或microRNAs抑制劑，Western Blotting結(jié)果中mi

6、croRNAs模擬物可降低LC3蛋白的表達(dá)水平，反之，microRNAs抑制劑可使LC3蛋白表達(dá)水平升高。熒光顯微鏡下觀察到，microRNAs模擬物使細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物減少，而microRNA抑制劑物卻增加了GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物的聚集。而且其余3個(gè)microRNAs模擬物對(duì)SKOV-3細(xì)胞中LC3表達(dá)無(wú)顯著變化；
　?。?）Western Blotting結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞的LC3-II蛋白表達(dá)回轉(zhuǎn)組高于

7、對(duì)照組回轉(zhuǎn)+氯化銨組顯著高于回轉(zhuǎn)組和對(duì)照組，熒光顯微鏡下觀察到GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物隨之增多。
　　結(jié)論
　　雷帕霉素可以誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞和MCF7細(xì)胞產(chǎn)生自噬效應(yīng)，miR-142-5p對(duì)MCF7細(xì)胞的自噬無(wú)明顯作用。而篩選出的與卵巢癌細(xì)胞自噬有關(guān)的4個(gè)microRNAs中亦有一個(gè)microRNAs對(duì)SKOV-3細(xì)胞自噬有影響，其余3個(gè)microRNAs對(duì)SKOV-3細(xì)胞自噬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自噬相關(guān) microRNAs分