星形膠質細胞調控未成熟腦神經干細胞關鍵分子的篩選與初步驗證.pdf

1、[目的]星形膠質細胞作為神經發(fā)生所必須的小生境中數量最豐富的細胞，可通過細胞間接觸和分泌可溶性因子調控神經干細胞的增殖和分化。然而，目前對星形膠質細胞產生哪些因子參與調控以及何種因子在其中起重要作用知之甚少。本課題擬通過運用體外細胞培養(yǎng)與干預、定量蛋白組學技術和生物信息學方法等，篩選在神經干細胞增殖和分化中發(fā)揮主要作用的關鍵分子并加以驗證。以期通過對關鍵分子的干預，探索促進未成熟腦損傷修復的有效途徑，為臨床早產兒腦損傷的治療提供新的思路

2、。
　　[方法]首先建立新生1日齡大鼠腦紋狀體星形膠質細胞和神經干細胞體外共培養(yǎng)體系，分別采用適度的氧糖剝奪、適宜濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸抑制星形膠質細胞的分泌功能。通過采用BrdU/Nestin和Tuj1/Nestin免疫熒光雙染，觀察共培養(yǎng)下的神經干細胞增殖、分化的改變，判斷星形膠質細胞的功能狀態(tài)。在成功建立細胞培養(yǎng)和干預模型的基礎上，收集各組星形膠質細胞培養(yǎng)上清，超濾濃縮后采用iTRAQ標記定量蛋白組學方法和生物信息學

3、分析方法，鑒定不同處理組與對照組上清中差異表達的分泌蛋白，并從中篩選出可能發(fā)揮主要作用的關鍵分子。對這些關鍵分子的作用通過已建立的細胞培養(yǎng)體系進一步加以驗證，探討其對神經干細胞的作用及其機制。
　　[結果]通過星形膠質細胞和神經干細胞非接觸狀態(tài)下共培養(yǎng)，我們證實了星形膠質細胞可以通過分泌可溶性因子調控神經干細胞的增殖和分化。分別經適度的氧糖剝奪、一定濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸處理后的星形膠質細胞分泌功能被抑制，不再具有促進神經

4、干細胞增殖和分化的能力，體外細胞共培養(yǎng)和干預的實驗模型成功建立。
　　采用iTRAQ標記定量蛋白組學技術在星形膠質細胞培養(yǎng)上清中共鑒定出375個蛋白，通過三個相互互補的分泌蛋白預測方法，確認其中有130個分泌蛋白，并且有44個蛋白系首次發(fā)現由星形膠質細胞分泌產生的。通過Geneontology分析，發(fā)現在這130個蛋白中，分別有29個蛋白參與調控細胞的分化、增殖和凋亡，18個蛋白參與調控免疫、炎癥防御、神經生理過程，29個蛋白屬于

5、細胞外基質蛋白。運用Proteinpilot軟件計算，顯示在氧糖剝奪、布雷福德菌素和氟代檸檬酸干預后分別有27、20、25個蛋白上調和33個、48個、27個蛋白下調；其中三個干預組共同上調的蛋白有4個，共同下調的蛋白有10個。
　　在共同變化蛋白中我們選取了4個變化最為顯著的(P<0.001)蛋白：Postn(下調)、Psap(下調)、Tpt1(上調)和Ppia(上調)進行初步的功能驗證。免疫印跡法檢測結果顯示這4種候選蛋白在星形

6、膠質細胞培養(yǎng)上清中的濃度變化與iTRAQ蛋白組學檢測的結果一致。體外細胞培養(yǎng)實驗證實Postn蛋白在加入神經干細胞培養(yǎng)體系3天起可顯著的促進神經干細胞的增殖(P<0.05)。
　　[結論]1.星形膠質細胞可以通過分泌可溶性因子影響神經干細胞的增殖和分化；2.星形膠質細胞分泌的130種蛋白主要參與調控細胞增殖、分化、凋亡、神經發(fā)育、免疫反應、以及細胞外基質構成和營養(yǎng)支持功能；3.Postn蛋白在體外環(huán)境可以促進神經干細胞的增殖，可能