肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)microRNAs的篩選驗(yàn)證及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的 MicroRNAs是近年來腫瘤分子標(biāo)志物研究的熱點(diǎn)。本研究的目的是篩選并鑒定能夠用于肝癌肝移植術(shù)后預(yù)警腫瘤復(fù)發(fā)的microRNA分子標(biāo)志物,并進(jìn)一步研究這些microRNAs的生物學(xué)功能、靶基因及信號通路,為明確肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　方法應(yīng)用Exqion human microRNA microarray分析5例肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和5例未復(fù)發(fā)的原發(fā)肝細(xì)胞癌組織樣本的miRNAs差異表達(dá)譜,并

2、應(yīng)用TaqmanqPCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。Kaplan-Meier和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析差異表達(dá)的miRNAs與肝癌肝移植術(shù)后病人生存和腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),研究差異表達(dá)的miRNAs對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)功能的影響。利用生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(TargetScan and miRDB)結(jié)合western bolt及免疫組化等實(shí)驗(yàn),鑒定miRNAs的靶基因,并對其作用的信號通路進(jìn)行相關(guān)研究,闡明差異表達(dá)的mi

3、RNAs在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射肝癌轉(zhuǎn)移模型,探討肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)miRNAs對體內(nèi)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的作用。
　　結(jié)果通過比較肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)組腫瘤microRNAs差異表達(dá)譜,得到18個(gè)腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNAs(Fold Change≥1.5,p＜0.05)。經(jīng)TaqmanqPCR在155例臨床肝癌肝移植術(shù)后原發(fā)肝癌樣本中對芯片篩選得到的表達(dá)差異最明顯

4、的6個(gè)miRNAs(Fold Change≥2:: miR-19a,miR-886-5p mig-126,miR-223,miR-24 and mig-147)進(jìn)行驗(yàn)證,與芯片結(jié)果完全一致。ROC(Receiver-operatingcharacteristic)分析發(fā)現(xiàn)這6個(gè)miRNAs都能以較高的敏感度和特異度區(qū)分肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)的原發(fā)肝癌。Kaplan-Meier和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型生存分析提示,這6個(gè)miRNAs的

5、表達(dá)特征能夠作為獨(dú)立的因素預(yù)測病人生存率(P=0.020)和無瘤生存率(p＜0.001)。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-19a表達(dá)能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移,并明顯增加細(xì)胞的凋亡率。生物信息學(xué)靶基因預(yù)測結(jié)合Western Blot分析,提示SOX4可能為miR-19a的潛在靶基因;裸鼠皮下成瘤及肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)miR-19a表達(dá)后能夠抑制肝癌細(xì)胞皮下成瘤及肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生;另外,下調(diào)miR-155表達(dá),可明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲。