豬偽狂犬病毒gE抗體檢測紅細胞凝集試驗方法和金標免疫層析法的建立及應用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀一種高度接觸性傳染病。目前，針對國內(nèi)廣泛使用PRVgE基因缺失苗進行接種免疫，通過檢測gE抗體即可區(qū)分出疫苗株和野毒株。
　　 本研究利用特異性引物從重組質(zhì)粒pMD-2E8ScFv和pMD-gE中PCR擴增出2E8基因（抗人紅細胞H抗原單鏈抗體基因）和kgE基因(P

2、RVgE主要抗原編碼區(qū))，采用重疊延伸(SOE) PCR法拼接成融合的雙功能分子2E8kgE，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，純化后，克隆至BamH1和EcoRI雙酶切的表達載體pET-Trx中，構(gòu)建了原核表達載體pET-Trx-2E8kgE;將pET-Trx-2E8kgE轉(zhuǎn)化至BL21plysS中，在IPTG誘導下表達具有雙功能的融合蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE和Western-blot檢測；結(jié)果表明，重組菌BL21plysS表達出約6

3、0.1kD的目的蛋白，與豬偽狂犬病陽性血清發(fā)生特異性反應。紅細胞凝集試驗證實，2E8kgE融合蛋白既能夠與人紅細胞結(jié)合，又能夠與PRV抗體反應，具有雙功能特性。
　　 以純化的抗人紅細胞單鏈抗體(ScFv)—豬偽狂犬病毒(PRV)gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測PRV gE抗體的紅細胞凝集試驗方法：利用方陣滴定試驗篩選出最佳抗原工作濃度為55μg/mL，血清最佳稀釋度為1：20，作用時間30min，與豬瘟(CSF)、豬細

4、小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬乙型腦炎（JE）、豬布氏桿菌病(Brucellosis)陽性血清和PRV gE缺失疫苗接種的豬免疫血清均不發(fā)生反應，與PRV陽性血清反應出現(xiàn)肉眼可見的凝集圈。與美國進口的PRV抗體檢測gE-ELISA診斷試劑盒檢測結(jié)果比較，50份豬血清的陰、陽性檢出符合率均為100％。紅細胞凝集試驗檢測方法具有敏感性和特異性較高的特點。
　　 與此同時，該研究以金標免疫層析法為基礎(chǔ)，以融合蛋白

5、為診斷抗原和膠體金標記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶，制備了PRVgE抗體檢測膠體金試紙條。利用方陣滴定試驗篩選出金標抗原最佳工作濃度為17.6μg，檢測線診斷抗原最佳標記量為1.76μg，血清最佳稀釋度為1：10，作用時間15min，與豬瘟(CSF)、豬細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬乙型腦炎（JE）、豬布氏桿菌病(Brucellosis)陽性血清和PRV gE缺失疫苗接種的豬免疫血清檢測線均不出現(xiàn)紅