力達(dá)霉素對(duì)肝腫瘤起始細(xì)胞表型的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝癌已經(jīng)成為全球致死率第五的腫瘤，臨床上化療藥物治療效果不佳，容易引起復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，腫瘤起始細(xì)胞的提出為肝癌的治療提供新的理論基礎(chǔ)。腫瘤起始細(xì)胞理論認(rèn)為：腫瘤起源于腫瘤起始細(xì)胞，其具有干細(xì)胞特性，主要包括自我更新、引起和維持腫瘤生長(zhǎng)、多向分化能力和耐藥性。本研究分別從分析人肝癌Huh7細(xì)胞不同表型的腫瘤起始細(xì)胞特性，以及力達(dá)霉素對(duì)Huh7肝腫瘤起始細(xì)胞的作用機(jī)制兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　 目的：
　　 1、首先證明

2、CD133和EpCAM雙表面分子標(biāo)記組合能更準(zhǔn)確地代表Huh7肝腫瘤起始細(xì)胞表型。
　　 2、進(jìn)一步研究抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素對(duì)Huh7腫瘤起始細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、首先，我們運(yùn)用流式細(xì)胞法和westernblot法分析比較了四種肝癌細(xì)胞株表面分子標(biāo)記的表達(dá)情況。然后運(yùn)用流式分選技術(shù)，分離出人肝癌Huh7細(xì)胞株表型分別為CD133+EpCAM+、CD133-EpCAM+、CD133+E

3、pCAM-和CD133-EpCAM-的四個(gè)亞群。在體外，我們對(duì)四個(gè)亞群細(xì)胞進(jìn)行了腫瘤起始細(xì)胞特性的比較：1）運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了血清培養(yǎng)條件下不同亞群細(xì)胞的分化能力；2）運(yùn)用平板和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)比較了各亞群細(xì)胞的自我更新能力；3）運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析了不同亞群細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐藥情況。另外，對(duì)分選后不同亞群細(xì)胞進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞成球培養(yǎng)，還檢測(cè)了干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。同時(shí)在體內(nèi)，我們運(yùn)用NOD/SCID小鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)比較了

4、四個(gè)亞群細(xì)胞體內(nèi)成瘤性。我們進(jìn)一步運(yùn)用基因芯片技術(shù)，比較了CD133+EpCAM+和CD133-EpCAM-亞群細(xì)胞microRNA的表達(dá)差異，并用定量PCR技術(shù)進(jìn)行了部分的驗(yàn)證。
　　 2、體外試驗(yàn)中，我們將未分選的Huh7細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞成球培養(yǎng)。在有限的連續(xù)三代傳代中，檢測(cè)肝癌Huh7細(xì)胞球的腫瘤起始細(xì)胞特性，包括用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)表面分子標(biāo)記（CD133和EpCAM）的變化，用real-timePCR方法檢測(cè)干細(xì)胞相

5、關(guān)基因的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，我們用力達(dá)霉素等不同化療藥物作用于肝癌Huh7細(xì)胞球，觀察不同化療藥物對(duì)細(xì)胞成球的影響。同時(shí)，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)力達(dá)霉素處理未分選的Huh7細(xì)胞后，醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)陽(yáng)性細(xì)胞的比例，還用westernblot法檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記(CD133和EpCAM)蛋白水平的變化。接著的體內(nèi)試驗(yàn)，我們運(yùn)用裸鼠皮下移植瘤模型檢測(cè)了力達(dá)霉素對(duì)肝癌Huh7腫瘤起始細(xì)胞的治療

6、效果。最后，進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制，用westernblot和T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)的方法，研究了力達(dá)霉素對(duì)GSK3β/β-catenin通路的活性影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、檢測(cè)結(jié)果顯示，在四種肝癌細(xì)胞株中Huh7細(xì)胞的CD133和EpCAM的共表達(dá)明顯高于其他三種細(xì)胞（Bel7402、Bel7404和SMMC7721）。在Huh7細(xì)胞中，CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞與CD133-EpCAM+、CD133+

7、EpCAM-和CD133-EpCAM-其他三個(gè)亞群細(xì)胞相比，具有更多的腫瘤起始細(xì)胞特性。這些特性包括：CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞具有更強(qiáng)的向其他三個(gè)亞群細(xì)胞分化的能力；CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞能形成更多更大的克??；CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平更高；CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞對(duì)化療藥物表現(xiàn)出更多的耐藥性;CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能形成更多更致密的腫瘤細(xì)胞球；同

8、時(shí),CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞在體內(nèi)具有更強(qiáng)的成瘤性和更短的成瘤時(shí)間。CD133+EpCAM+與CD133-EpCAM-亞群細(xì)胞相比，在microRNA的表達(dá)水平上存在明顯的差異。
　　 2、體外成球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，未分選的Huh7細(xì)胞在有限的連續(xù)三代傳代中，隨著腫瘤細(xì)胞球傳代數(shù)的增加，表面分子標(biāo)記（CD133和EpCAM）的表達(dá)和干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平也明顯增加，結(jié)果說(shuō)明有限的連續(xù)三代傳代的Huh7細(xì)胞球部分具有了腫瘤起始細(xì)

9、胞的特性。力達(dá)霉素能顯著的抑制細(xì)胞球的形成，減少細(xì)胞球的數(shù)目和大小，效果明顯優(yōu)于其他幾種常用化療藥物（阿霉素和順鉑）。不同濃度力達(dá)霉素作用于未分選的Huh7細(xì)胞后，能減少腫瘤起始細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD133和EpCAM的蛋白表達(dá)量，同時(shí)也能降低醛脫氫酶陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，力達(dá)霉素能顯著縮小腫瘤體積，推遲腫瘤的發(fā)生時(shí)間。進(jìn)一步研究顯示，力達(dá)霉素作用于腫瘤起始細(xì)胞的可能分子機(jī)制是：無(wú)論在體內(nèi)和體外力達(dá)霉素都能顯著下調(diào)GSK3β/β-c

10、atenin通路的活性，主要通過(guò)激活GSK3β，抑制β-catenin的活性，減少β-catenin的核轉(zhuǎn)移和降低β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄因子的活性。
　　 結(jié)論：
　　 1、CD133+EpCAM+亞群細(xì)胞能更準(zhǔn)確的代表肝癌Huh7細(xì)胞中的腫瘤起始細(xì)胞。這也更有利于進(jìn)一步研究腫瘤起始細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制和進(jìn)行針對(duì)腫瘤起始細(xì)胞治療藥物的篩選。
　　 2、有限連續(xù)傳代的Huh7細(xì)胞球部分具有腫瘤起始細(xì)胞的特性，能