高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中病毒基因組的生物信息學(xué)分析方法探索.pdf

1、病毒是一類只能夠在活著的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的感染源。病毒個(gè)體微小、構(gòu)造簡(jiǎn)單，除朊病毒（僅由蛋白構(gòu)成）外，病毒均由一種作為遺傳物質(zhì)的核酸（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒種類多樣，宿主范圍廣，具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物均可以是病毒的宿主。病毒基因組作為病毒遺傳信息的載體，是研究病毒的核心數(shù)據(jù)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及，對(duì)病毒基因組進(jìn)行高通量測(cè)序已成為研究病毒遺傳、進(jìn)化的主要手段。面對(duì)高通量測(cè)序產(chǎn)出的大量數(shù)據(jù)，就要求生物信息學(xué)分析能夠盡可能多地挖掘出

2、其中病毒基因組的有效信息。本文的研究目的即是探索出不同數(shù)據(jù)類型下，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中病毒基因組的生物信息學(xué)分析方法。
　　本文從課題組積累的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)及分析需求出發(fā)，探索了從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中挖掘病毒基因組中有效信息的分析方法。本文圍繞病原微生物，分析其測(cè)序數(shù)據(jù)中病毒基因組的相關(guān)信息，具體分為兩個(gè)部分：
　　1、細(xì)菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中溶原性噬菌體的分析；
　　2、復(fù)雜測(cè)序樣品中的病毒發(fā)現(xiàn)及基因組分析。
　　細(xì)菌高通

3、量測(cè)序數(shù)據(jù)中溶原性噬菌體的分析
　　溶原性噬菌體是一類能夠整合入宿主菌基因組中，隨宿主菌的復(fù)制而傳代的病毒。在某些條件的誘導(dǎo)下，也能夠脫離宿主基因組，產(chǎn)生子代噬菌體釋放出來。溶原性噬菌體的復(fù)制特性決定了它具有介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移的功能，往往能夠?qū)λ拗骶闹虏⌒援a(chǎn)生重要影響，如德國(guó)發(fā)現(xiàn)的腸出血性大腸桿菌O104:H4的主要毒力基因就是由前噬菌體所編碼。本文以分離自足部潰爛病人的72株細(xì)菌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)為研究對(duì)象，以溶原性噬菌體復(fù)制機(jī)制為

4、理論模型，研究發(fā)現(xiàn)新的溶原性噬菌體基因組及其整合特征，為了解噬菌體的生物學(xué)特性及防控高致病性細(xì)菌感染提供基礎(chǔ)。
　　采用生物信息學(xué)軟件與自編程序相結(jié)合的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。使用NGS QC Toolkit v2.3.3對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除短讀長(zhǎng)及低質(zhì)量數(shù)據(jù)。針對(duì)Ion Torrent平臺(tái)數(shù)據(jù)特點(diǎn)，選擇了商業(yè)軟件Newbler v3.0作為數(shù)據(jù)組裝軟件。使用perl腳本編程，搭建前噬菌體預(yù)測(cè)分析流程，對(duì)組裝得到的co

5、ntigs進(jìn)行前噬菌體預(yù)測(cè)。為得到活躍的前噬菌體基因組，選用兩種輔助拼接工具，ContigScape插件顯示組裝后contigs之間的連接信息，商業(yè)軟件CLC Genomics Workbench9進(jìn)行序列調(diào)整及拼接結(jié)果檢查。使用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部軟件對(duì)contigs進(jìn)行連接。同時(shí)使用RAST在線注釋工具對(duì)得到的溶原性噬菌體基因組進(jìn)行注釋。最后，綜合分析得到的溶原性噬菌體基因組結(jié)構(gòu)、整合位點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系等信息，挖掘其中的潛在信息。
　　在7

6、2株細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)中，共有11株細(xì)菌數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了前噬菌體脫離細(xì)菌基因組進(jìn)行復(fù)制的現(xiàn)象。對(duì)能夠脫離細(xì)菌基因組進(jìn)行復(fù)制的噬菌體序列進(jìn)行拼接，共得到14個(gè)活化的前噬菌體全基因組序列，其中11株與目前已知的噬菌體序列同源性很低，為本文新發(fā)現(xiàn)的噬菌體序列。新序列的發(fā)現(xiàn)表明本文研究方法可用于新溶原性噬菌體的發(fā)現(xiàn)，增加科研人員對(duì)噬菌體的認(rèn)知。分析發(fā)現(xiàn)，整合狀態(tài)下噬菌體整合酶基因均與其整合位點(diǎn)緊鄰。溶原性噬菌體的整合位點(diǎn)序列長(zhǎng)短特征不一，但表現(xiàn)出與其整

7、合酶具有相關(guān)性。同一整合位點(diǎn)可供多種具有相似整合酶的溶原性噬菌體整合，提供了前噬菌體預(yù)測(cè)的新思路。宿主為同一屬內(nèi)的細(xì)菌的溶原性噬菌體具有相似的基因組結(jié)構(gòu)。
　　復(fù)雜測(cè)序樣品中的病毒發(fā)現(xiàn)及基因組分析
　　由于病毒分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成功率低，我們常常要對(duì)一些復(fù)雜樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，然后獲取其中的有效病毒信息，這就給數(shù)據(jù)分析帶來了一定的挑戰(zhàn)。課題組近年來開展了使用高通量測(cè)序?qū)εR床樣品進(jìn)行病原檢測(cè)的工作，要求數(shù)據(jù)分析能夠快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)

8、臨床樣品中的病原。目前單一的生物信息學(xué)軟件不能滿足我們對(duì)于復(fù)雜測(cè)序樣品的分析需求，鑒于此開發(fā)了分析軟件《高通量測(cè)序數(shù)據(jù)病原體歸類分析軟件v1.0》。該軟件能夠?qū)?xì)菌、真菌、原蟲、病毒4種類型的病原進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)在應(yīng)對(duì)復(fù)雜樣品中已知或未知病毒的發(fā)現(xiàn)工作表現(xiàn)出良好的效果。
　　復(fù)雜樣品中已知病毒的發(fā)現(xiàn)，以2016年7月北京發(fā)現(xiàn)的輸入性裂谷熱病例為例。通過使用分析軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了大量的裂谷熱病毒序列，確認(rèn)了裂谷熱病毒為致病原，

9、并在第一時(shí)間獲得了該株裂谷熱病毒的全基因組序列。該株裂谷熱病毒與2009年南非發(fā)現(xiàn)的Kakamas株同源性最高，進(jìn)化分析提示該株病毒沒有發(fā)生重組。
　　復(fù)雜樣品中未知病毒的發(fā)現(xiàn)，以勐海彈狀病毒的發(fā)現(xiàn)為例。該株病毒分離自云南勐海地區(qū)捕獲的白紋伊蚊，以C6/36細(xì)胞培養(yǎng)后，使用常見病毒引物無法鑒定出是何種病毒。通過對(duì)其高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，排除掉宿主細(xì)胞、其他細(xì)菌、病毒等干擾因素，獲得了該株病毒的全基因組序列。序列分析顯示其為一株新型

10、的彈狀病毒，命名為勐海彈狀病毒，與發(fā)現(xiàn)于秘魯?shù)牧硗鈨芍晡妹綇棤畈《咀顬橄嗨啤?br>　　在對(duì)勐海彈狀病毒的基因組分析中，本文還對(duì)選取的93株彈狀病毒參考序列進(jìn)行了病毒末端序列分析。發(fā)現(xiàn)其中的45株均具有短反向重復(fù)末端序列的特點(diǎn)，分布于不同的屬中?？袢《緦賰?nèi)具有非常一致的末端序列“ACGCTTAAC”，而Ephemerovirus、Vesiculovirus、Tibrovirus和Sprivivirus四個(gè)屬的病毒則均有“ACGAAGA

11、”的一致末端序列。病毒基因組的末端序列常常與其基因組復(fù)制相關(guān)，其末端序列往往是相對(duì)嚴(yán)格的，這表明短反向重復(fù)末端序列很可能是彈狀病毒科病毒基因組的一類特點(diǎn)。
　　綜上，本文在現(xiàn)有病毒基因組分析方法的基礎(chǔ)上，提出了以細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)分析活化的前噬菌體全基因組及其整合位點(diǎn)的分析方法，能夠用于新溶原性噬菌體發(fā)現(xiàn)，為了解溶原性噬菌體提供新知識(shí)。開發(fā)了高通量測(cè)序數(shù)據(jù)病原體歸類分析軟件，取得軟件著作權(quán)，并在未知病原檢測(cè)中發(fā)揮良好的作用。通過數(shù)據(jù)分析