尿道致病性大腸埃希菌全基因組高通量測序及生物信息學數(shù)據(jù)分析.pdf

1、目的：
　　1、用第二代高通量測序儀完成一株多重耐藥尿道致病性大腸埃希菌(uropathogemic Escherichia coli，UPEC) NB8株的全基因組測序;
　　2、從NB8全基因組測序數(shù)據(jù)中挖掘出粘附素、菌毛、鐵攝取系統(tǒng)、蛋白酶、毒素、抗原43、毒力島等多種毒力因子及其組成形式，以闡明該菌株可能存在的致病機制;挖掘出β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、多粘菌素、磺胺類和四環(huán)素類等耐藥基因的攜帶情

2、況及接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件和外排泵的存在和組成形式，以闡明該株多重耐藥UPEC可能存在的耐藥機制。
　　3、對NB8株做耐藥基因的比較基因組學分析，以及菌株反應(yīng)代謝通路的分析。
　　方法：
　　1、選取一株多重耐藥的尿道致病性大腸埃希菌NB8，采用16S rDNA和gyrA基因測序方法進行菌株鑒定和確認，瓊脂稀釋法檢測臨床常用抗菌藥物對菌株的敏感性，并收集和分析該菌株的相關(guān)臨床資料;

3、>　　2、采取隨機散彈式打斷法構(gòu)建DNA文庫，使用Illumina HiSeq與Ion TorrentPGM兩種平臺進行測序，針對缺口設(shè)計引物，得到PCR產(chǎn)物后再使用Sanger測序法填補缺口，最后采用多種生物信息學軟件對NB8株全基因組做基因和功能注釋;
　　3、從NB8株全基因組數(shù)據(jù)中挖掘出和UPEC致病力相關(guān)的毒力因子遺傳信息及組成分析;
　　4、從菌株全基因組數(shù)據(jù)中分析UPEC耐藥性相關(guān)基因、遺傳信息及組成;

4、　　5、將NB8株和GENBANK上登陸的9株完成全基因組測序的大腸埃希菌的耐藥基因進行比較基因組學分析;
　　6、采用KEGG軟件進行NB8株反應(yīng)代謝通路分析。
　　結(jié)果：
　　1、多重耐藥尿道致病性大腸埃希菌(NB8株)經(jīng)16S rDNA和gyrA基因測序、GenBank比對確認為大腸埃希菌。菌株對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢替坦、氨芐西林/舒巴坦、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)

5、丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、紅霉素、四環(huán)素、多粘菌素均耐藥;對哌拉西林/也唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦中介;對亞胺培南、美羅培南敏感。
　　2、NB8株經(jīng)Illumina HiSeq與Ion Torrent PGM測序儀進行平行測序，二種儀器測得序列合并組裝后PCR法補缺口。最終得到一條推定的染色體序列，長4，550，369bp（內(nèi)含14個缺口）。推定的質(zhì)粒序列，長635，377bp（內(nèi)含33個缺口）。
　　3、NB8株全基

6、因組數(shù)據(jù)中挖掘出多種毒力基因:包括粘附素基因、P菌毛基因papⅠ、papⅩ和2個拷貝的papB)、1型菌毛基因(fimB、fimX和2個拷貝的fimE)、大腸埃希菌共同菌毛基因ecpD及其它菌毛基因(matA和fml);產(chǎn)氣菌素基因(iucA、iucB、iucC);血紅素攝取(Chu)基因(ccmA、ccmB、ccmC和ccmD);腸桿菌素基因(seNB、fepC和fepE);分泌自轉(zhuǎn)運毒素基因絲氨酸蛋白酶自轉(zhuǎn)運體基因;溶血素基因hly

7、D;抗原43基因及2個拷貝的SHI-2毒力島基因。
　　4、全基因組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，該菌株攜帶多種耐藥基因:包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（A類β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM-1，blaTEM-15和2個拷貝的blacTX-M-3，C類β-內(nèi)酰胺酶基因ampC，以及PBP靶位基因突變和膜孔蛋白基因突變;氨基糖苷類耐藥基因(核苷轉(zhuǎn)移酶基因(ANT) ant(3")-Ⅰ、磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH) aph(6)-Ⅰd、aph(3")-Ⅰb、乙酰轉(zhuǎn)

8、移酶(AAC) aac(3)-Ⅱ);喹諾酮類耐藥基因突變點(GyrA蛋白83位由TCG(S)突變?yōu)門TG(L)，83位由GAC(D)突變?yōu)锳AC(N)，ParC蛋白80位由AGC(S)突變?yōu)锳TT(Ⅰ));大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(2'-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因mph(2')-Ⅰ、大環(huán)內(nèi)酯類轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合/通透酶基因macA);多粘菌素耐藥基因arnA;磺胺類耐藥基因(二氫葉酸合成酶基因sul1、sul2、二氫葉酸還原酶dfrA17);四環(huán)素類耐藥基因

9、(tetA和2個拷貝的tetC)。并在NB8株染色體基因組片段序號5048至5052中發(fā)現(xiàn)一個Ⅰ類整合子，包含dfrA17、ant(3")-Ⅰ、SMR family和sul1四個耐藥基因盒。
　　5、從菌株全基因組數(shù)據(jù)中挖掘出多種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件和外排泵基因。
　　6、NB8株和9株已完成全基因組測序的大腸埃希菌耐藥基因的比較基因組學分析結(jié)果顯示:NB8株攜帶的耐藥基因最多，其次是禽源性大

10、腸埃希菌APECO1株，其它8株菌攜帶的耐藥基因相對較少。NB8株和UTI89株、CFT073株、536株同屬尿道致病性大腸埃希菌(UPEC)，但NB8株攜帶的耐藥基因明顯多于其它三株UPEC。這10株菌中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因ampC、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因macA、多粘菌素類耐藥基因arnA的攜帶率均較高，而其它耐藥基因的攜帶率較低。NB8株和9株比對菌株外排泵基因的攜帶率都非常高。
　　7、NB8株KEGG反應(yīng)代謝通路分析提示NB

11、8株參與多個通路，包括鞭毛裝配通路、細菌分泌系統(tǒng)通路、病原相關(guān)分子模式(PAMPs)與該蛋白相互作用的模式識別蛋白(PRPs)的關(guān)系通路、β-內(nèi)酰胺類耐藥通路、雙成份系統(tǒng)通路、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體通路、葉酸合成通路、葉酸碳庫通路、肽聚糖合成通路、氨基糖、核糖新陳代謝通路、青霉素和頭孢菌素合成通路、百日咳致病機制通路等。
　　結(jié)論：
　　1、多重耐藥尿道致病性大腸埃希菌NB8株的遺傳學背景明確，全基因組數(shù)據(jù)中挖掘的多種耐藥基因是

12、導(dǎo)致NB8株對多種抗菌藥物耐藥的重要原因，主動外排機制增強也會導(dǎo)致或者增強NB8株的耐藥性。可移動遺傳元件（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等）能使細菌的耐藥性迅速播散，使受體菌呈多藥耐藥。
　　2、NB8株中檢出的多種毒力因子可能會在細菌粘附、侵襲、溶細胞活性、細胞毒性等方面起著重要作用，并能增強細菌的生存能力和致病力，導(dǎo)致宿主的泌尿道感染。
　　3、比較基因組學分析提示NB8株攜帶的耐藥基因最多，KEGG反應(yīng)代謝通路分析提示其參與多